Denne metoden adresserer utfordringene i dyp fluorescensobservasjon i risskudd, for eksempel en begrenset vevspenetrasjon av clearingløsningen og den virkelige oppløsningen under konfokalmikroskop. Den største fordelen med denne teknikken er en strukturobservasjon av mye stort vev fra et makroperspektiv, til og med spørsmål med hardt og tykt vev, for eksempel voksen-eriserte skudd. Denne metoden gjelder dyp avbildning av hardt og tykt vev i brede plantearter.
Det kan bidra til å akselerere oppdagelsen av nye fenomener i plantebiologisk forskning. For å begynne, kutt røttene forsiktig uten å skade plantene og vask dem med vann for å fjerne smuss. Bruk nå pinsett for å skrelle av de gamle ytre bladene.
For å unngå å knuse cellene, bruk en enkeltkantet barberhøvel med glidende bevegelse for å kutte vevet fra skuddet, apikal meristem eller ung panicle til basen. Hvis posisjonen til skuddet apikal meristem eller ung panicle ikke er synlig, kutt den lenger. Risskuddet har et ovalt tverrsnitt.
Bruk en tveegget barberhøvel til å barbere av den ene siden av ovalen tynt, i retning av den lange aksen. Bekreft posisjonen til skuddet apikal meristem eller ung panicle ved utseendet av en hvit-ish farge i prøven og trim av overflødig vev. Sett prøven i et 1,5 milliliter mikrosentrifugerør som inneholder en milliliter fikseringsmiddel.
Klipp et 2,5 kvadratcentimeter stykke parafinfilm og form det til en ball. Plasser nå disse ballene på toppen av prøvene for å forhindre at de flyter ut av fikseringsløsningen. Plasser røret som inneholder prøven i en desiccator.
Lukk lokket på desiccator og start vakuumpumpen for sakte å trykkavlaste innsiden av desiccator til minus 0,095 megapascal trykk er nådd. Etter å ha lukket tørkemidlet ved minus 0,095 megapascal, slå av vakuumpumpen og la den stå i 30 minutter ved romtemperatur. Åpne desiccator litt og sakte returnere den til atmosfærisk trykk.
Hvis prøven er riktig festet, synker den ned i fikseringsløsningen. Og hvis det ikke synker, reduser trykket igjen. Fjern parafinfilmen.
Lukk lokket, og hold rørene over natten ved fire grader Celsius. Bruk lofrie våtservietter til å fjerne overflødig fikseringsmiddel fra prøven og fest prøven på et vibrerende mikroslicerbrett med øyeblikkelig lim. Legg prøven på et brett med den flate siden ned som ble barbert av under prøvetakingen, og still inn beskjæringsforholdene i henhold til den faste prøven.
Juster prøveposisjonen med revers- eller fremoverknappen og opp- eller nedknappen og fyll skuffen med avionisert vann til alle prøvene er nedsenket. Etter å ha fylt skuffen, trykk på startknappen og legg de trimmede prøvene på et glassglass med en dråpe PBS. Kontroller prøven som inneholder målstedet under et stereomikroskop, og overfør den trimmede prøven til en flerbrønnsplate med en milliliter PBS.
Fjern PBS fra flerbrønnsplaten. Tilsett fersk PBS og la den stå i ett minutt. Fjern PBS og legg til CS. Plasser flerbrønnsplaten som inneholder prøven i en tørkemiddel og lukk lokket.
Start deretter vakuumpumpen for å trykkavlaste innsiden av desiccator til minus 0,09 megapascal, sakte. Etter å ha lukket tørkemidlet ved minus 0,09 megapascal, slå av vakuumpumpen og la den stå i en time ved romtemperatur. Åpne desiccator litt og sakte returnere den til atmosfærisk trykk.
Hell avionisert vann i gapet mellom brønnene for å forhindre fordampning av CS og oppbevar flerbrønnsplatene ved romtemperatur i mørket for rydding. Når CS blir grønn, bytt den ut med en ny løsning. De ikke-trimmede prøvene forble grønne og ble ikke gjennomsiktige etter tre måneders behandling med de CS.In prøvene som ble skrellet av alle blader mellom nodene ble hvite etter en uke, selv om nodene forble grønne.
Prøven ble ikke gjennomsiktig etter fire uker. De håndtrimmede prøvene ble hvite etter en ukes CS-behandling, men ble ikke gjennomsiktige etter fire uker. Prøvene trimmet til 130 mikrometer tykkelse ble gjennomsiktige etter en ukes CS-behandling.
Prøven var nesten gjennomsiktig etter to uker. I noden var den observerbare dybden etter en uke av CS-behandlingen minus 60 mikrometer og minus 90 mikrometer etter to uker. Fluorescerende signaler ble observert på en dybde på minus 80 mikrometer på tre uker og på en dybde på minus 100 mikrometer på fire uker.
I internoden ble fluorescerende signaler observert på en dybde på minus 60 mikrometer uten CS-behandlingen. Den observerbare dybden var minus 90 mikrometer etter en uke til tre uker av CS-behandlingen og minus 100 mikrometer etter fire uker. I bladene ble fluorescerende signaler observert på en dybde på minus 90 mikrometer uten CS-behandling, men lysstyrken var svakere enn andre vev.
Etter en uke var signalene lysere og observert på en dybde på minus 120 mikrometer. Uttrykket av transkripsjonsfaktoren OS MASU 15 mOrange ble observert hos unge Panicle, blad, node, internode og fleurette. Nøkkelen er å finne de beste forholdene for plantene eller vevene, for eksempel periode- og vakuumtrykk, eller posisjon, og CS-behandling, timing, tykkelse, hastighet og passende fargeløsning.
Kombinasjonen av timing og herdingsteknologi tillater romlig tidsmessig observasjon av genuttrykksmønster og intercellulær kommunikasjon i flere vev i en enkelt seksjon.