Denna metod adresserar utmaningarna i Deep Fluorescence Observation in Rice Shoots, såsom en begränsad vävnadspenetration av clearinglösningen och den verkliga upplösningen under konfokalmikroskop. Den största fördelen med denna teknik är en strukturobservation av mycket stora vävnader ur ett makroperspektiv, även uppmaningar med hårda och tjocka vävnader, såsom vuxna eriserade skott. Denna metod gäller för djup avbildning av hårda och tjocka vävnader i breda växtarter.
Det kan bidra till att påskynda upptäckten av nya fenomen inom växtbiologisk forskning. För att börja, skära rötterna försiktigt utan att skada växterna och tvätta dem med vatten för att ta bort smuts. Använd nu pincett för att skala av de gamla yttre bladen.
För att undvika att krossa cellerna, använd en enkantig rakhyvel med en glidande rörelse för att skära vävnaden från skottet, apikal meristem eller ung panikel till basen. Om positionen för skottets apikala meristem eller unga panikel inte är synlig, skär den längre. Risskottet har ett ovalt tvärsnitt.
Använd en tveeggad rakhyvel för att raka av ena sidan av ovalen tunt, i riktning mot dess långa axel. Bekräfta positionen för skottet apikal meristem eller ung panikel genom utseendet på en vitaktig färg i provet och trimma bort överflödig vävnad. Lägg provet i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör innehållande en milliliter fixeringslösning.
Skär en 2,5 kvadratcentimeter bit paraffinfilm och forma den till en boll. Placera nu dessa bollar ovanpå proverna för att förhindra att de flyter ut ur fixeringslösningen. Placera röret som innehåller provet i en exsickator.
Stäng locket på exsickatorn och starta vakuumpumpen för att långsamt trycksätta insidan av exsickatorn tills minus 0,095 megapascals tryck har uppnåtts. När du har stängt torkbehållaren vid minus 0,095 megapascal, stäng av vakuumpumpen och låt den stå i 30 minuter vid rumstemperatur. Öppna exsickatorn något och återför den långsamt till atmosfärstrycket.
Om provet är korrekt fixerat sjunker det in i fixeringslösningen. Och om det inte sjunker, minska trycket igen. Ta bort paraffinfilmen.
Stäng locket och håll rören över natten vid fyra grader Celsius. Använd luddfria våtservetter, ta bort den överflödiga fixeringslösningen från provet och fixera provet på en vibrerande mikroskivbricka med omedelbart lim. Placera provet på en bricka med den plana sidan nedåt som rakades av under provtagningen och ställ in trimningsförhållandena enligt det fasta provet.
Justera provpositionen med bakåt- eller framåtknappen och upp- eller nedknappen och fyll brickan med avjoniserat vatten tills alla prover är nedsänkta. När du har fyllt brickan trycker du på startknappen och placerar de trimmade proverna på en glasskiva med en droppe PBS. Kontrollera provet som innehåller målplatsen under ett stereomikroskop och överför det trimmade provet till en flerbrunnsplatta med en milliliter PBS.
Ta bort PBS från flerbrunnsplattan. Tillsätt färsk PBS och låt den stå i en minut. Ta bort PBS och lägg till CS. Placera flerbrunnsplattan som innehåller provet i en exsickator och stäng locket.
Starta sedan vakuumpumpen för att trycksätta insidan av exsickatorn tills minus 0,09 megapascal, långsamt. När du har stängt exsickatorn vid minus 0,09 megapascal, stäng av vakuumpumpen och låt den stå i en timme vid rumstemperatur. Öppna exsickatorn något och återför den långsamt till atmosfärstrycket.
Häll avjoniserat vatten i gapet mellan brunnarna för att förhindra avdunstning av CS och förvara flerbrunnsplattorna vid rumstemperatur i mörkret för rensning. När CS blir grön, byt ut den med en ny lösning. De otrimmade proverna förblev gröna och blev inte transparenta efter tre månaders behandling med de CS.In proverna som skalades av alla lämnar internoderna vita efter en vecka, även om noderna förblev gröna.
Provet blev inte transparent efter fyra veckor. De handtrimmade proverna blev vita efter en veckas CS-behandling men blev inte transparenta efter fyra veckor. Proverna trimmade till 130 mikrometers tjocklek blev genomskinliga efter en veckas CS-behandling.
Provet var nästan transparent efter två veckor. I noden var det observerbara djupet efter en vecka av CS-behandlingen minus 60 mikrometer och minus 90 mikrometer efter två veckor. Fluorescerande signaler observerades på ett djup av minus 80 mikrometer vid tre veckor och på ett djup av minus 100 mikrometer vid fyra veckor.
I internoden observerades fluorescerande signaler på ett djup av minus 60 mikrometer utan CS-behandlingen. Det observerbara djupet var minus 90 mikrometer efter en vecka till tre veckor av CS-behandlingen och minus 100 mikrometer efter fyra veckor. I bladen observerades fluorescerande signaler på ett djup av minus 90 mikrometer utan CS-behandling, men ljusstyrkan var svagare än andra vävnader.
Efter en vecka var signalerna ljusare och observerades på ett djup av minus 120 mikrometer. Uttrycket av transkriptionsfaktorn OS MASU 15 mOrange observerades hos unga Panicle, blad, nod, internod och fleurette. Nyckeln är att hitta de bästa förutsättningarna för växterna eller vävnaderna, till exempel period- och vakuumtryck, eller position, och CS-behandling, timing, tjocklek, hastighet och lämplig färgningslösning.
Kombinationen av timing och härdningsteknik möjliggör rumslig tidsmässig observation av genuttrycksmönster och intercellulär kommunikation i flera vävnader i en enda sektion.