इस एलिगन की आंत का हाथ विच्छेदन एक शक्तिशाली लेकिन सरल तकनीक है जो सेल-विशिष्ट आबादी में ऊतक को अलग करके पोस्ट बायोलॉजी के विभिन्न पहलुओं की जांच को सक्षम बनाता है। यह ठीक पैमाने पर ऊतक विच्छेदन तकनीक प्रदर्शन करना आसान है और मानक प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग करता है, जिससे यह कई लोगों के लिए एक मजबूत और सुलभ विधि बन जाती है। सुई खींचने वाले का उपयोग करके 4 इंच लंबे और 1.2 मिलीमीटर बाहरी व्यास मानक ग्लास केशिका को इंजेक्शन सुई आकार में खींचकर शुरू करें।
कम से कम 5 50 और 100 माइक्रोमीटर माइक्रो केशिका पिपेट तैयार करें। माइक्रो केशिका पिपेट को क्रमशः 3 या 5 टिक चिह्नों पर टिक करके 50 माइक्रोमीटर या 100 माइक्रोमीटर तक बनाने के लिए माइक्रो फोर्ज का उपयोग करें, जैसा कि 5 एक्स ऑब्जेक्टिव लेंस के तहत माइक्रो फोर्ज ओकुलर रूलर द्वारा इंगित किया गया है। फिर मुंह की श्वास नली पर एक माइक्रो केशिका पिपेट चिपकाएं।
35 मिलीमीटर व्यास बाँझ पेट्री डिश में 2 मिलीलीटर एम 9 और अन्य 35 मिलीमीटर व्यास बाँझ पेट्री डिश में 2 मिलीलीटर विच्छेदन बफर जोड़कर एक एम 9 स्नान और एक विच्छेदन बफर स्नान तैयार करें। अंत में, प्रत्येक स्नान में काम करने वाले गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन या बीएसए समाधान के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें, और इसे घुमाकर मिलाएं। विच्छेदन सरणी तैयार करने के लिए दो अच्छी तरह से कॉनकैविटी स्लाइड के पहले कुएं में 150 माइक्रोलीटर काम करने वाले लेविसोल समाधान और दूसरे कुएं में विच्छेदन बफर के 150 माइक्रोलीटर जोड़ें।
प्रत्येक कुएं में काम करने वाले बीएसए समाधान के 20 माइक्रोलीटर जोड़ें। केनोरहाब्डिस एलिगेंस सीएल 2122 कृमि आंत को हाथ से विच्छेदित करने के लिए, नेमाटोड विकास माध्यम या एनजीएम प्लेट से 20 वयस्क कीड़े को कीड़ा पिक का उपयोग करके एम 9 स्नान में ले जाएं। फिर सभी 20 कीड़े को एम 9 स्नान से विच्छेदन बफर स्नान में ले जाएं।
अगला विच्छेदन बफर स्नान से 10 कीड़े के बैचों को लेवमिसोल समाधान वाले कुएं में ले जाएं। एक बार जब कीड़े की गति धीमी हो जाती है तो उन्हें जल्दी से लेवैमिसोल वेल से विच्छेदन बफर वाले कुएं में ले जाएं। विच्छेदन शुरू करने से पहले कीड़े को विच्छेदन बफर में थोड़ा हिलना शुरू करने दें।
एक फ्लोरोसेंट विच्छेदन दायरे के तहत, आंत के पूर्ववर्ती मध्य आधे और मध्य पीछे के आधे वर्गों की समान संख्या का उत्पादन करने के लिए हाइपोडर्मिक सुई का उपयोग करके ग्रसनी के ठीक पीछे या मलाशय के सामने एक कट बनाएं। आंतों को शरीर से अधिकतम रूप से बाहर निकालने के लिए लगभग एक मिनट की प्रतीक्षा करते समय, आरएनए क्षरण को कम करने में मदद करने के लिए कुएं में 50 माइक्रोलीटर चेलेशन बफर जोड़ें। आंत एक्सट्रूज़न की सुविधा के लिए मुंह के एस्पिरेटर से जुड़े 100 माइक्रोमीटर माइक्रो केशिका पिपेट का उपयोग करें और पिपेट के अंदर और बाहर कीड़े को खींचें।
एक बार जब एक आंत को पर्याप्त रूप से बाहर निकाल दिया जाता है तो इसे शरीर के बाकी हिस्सों और किसी भी शेष गोनाड से काटने के लिए 27 गेज हाइपोडर्मिक सुई का उपयोग करें। माइक्रो केशिका पिपेट का उपयोग करके आंतों के खंड को एस्पिरेट करें और इसे न्यूक्लिक एसिड अलगाव अभिकर्मक युक्त माइक्रो सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। अलग आंतों को बर्फ पर रखें और शेष आंतों के लिए प्रक्रिया दोहराएं।
इस विधि ने आंतों के सफल विच्छेदन और अलगाव का प्रदर्शन किया। विधि ने पृथक आंतों से आरएनए अलगाव और माइक्रोबियल निगरानी की भी सूचना दी। चूंकि सीएल 2122 कीड़े जीएफपी से जुड़े आंत विशिष्ट धातु दो प्रमोटर को परेशान करते थे, आंत को फ्लोरोसेंट विच्छेदन दायरे के तहत एक हरे रंग की चमक के रूप में देखा गया था।
वयस्क कीड़े के विच्छेदन ने ग्रसनी के ठीक पीछे एक प्राथमिक चीरा लगाने के बाद एक एक्सट्रूडेड आंत प्रदर्शित की। आंतों के खंड का सफल विच्छेदन गोनाड या शव के मलबे जैसे दिखाई देने वाले दूषित पदार्थों से मुक्त दिखाई दिया। इसके विपरीत, असफल विच्छेदन ने आंतों के खंड से जुड़े गोनैड और शव को प्रदर्शित किया।
हाथ विच्छेदन से आरएनए पैदावार अधिक कुशल थी क्योंकि 60 कुल आंत वर्गों के अंतिम नमूने ने उच्च गुणवत्ता वाले कुल आरएनए के लगभग 15 नैनोग्राम प्राप्त किए। आंतों की कोशिकाओं का कृमि विघटन और एफएसीएस अलगाव कम कुशल था क्योंकि कुल आरएनए की अनुरूप मात्रा प्राप्त करने के लिए सैकड़ों हजारों आंतों की कोशिकाओं की आवश्यकता होती थी। पैन-बैक्टीरियल डिटेक्शन परख का उपयोग करके कुल माइक्रोबियल जीनोमिक डीएनए प्रवर्धन से पता चला है कि पूर्ववर्ती, मध्य और मध्य पीछे के क्षेत्रों से 40 कुल आंत वर्गों के अंतिम नमूने ने कुल माइक्रोबियल डीएनए के लगभग 0.009 पिकोग्राम की कम लेकिन पता लगाने योग्य मात्रा प्राप्त की।
इस प्रक्रिया को करते समय याद रखने वाली सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि विच्छेदन से पहले कीड़े को अधिक लकवाग्रस्त न करें क्योंकि यह अधिकतम आंत एक्सट्रूज़न को रोक सकता है।