このエレガンスの腸の手解剖は、細胞特異的集団の組織を分離することにより、ポストバイオロジーのさまざまな側面の調査を可能にする強力でありながら簡単な技術です。この微細な組織解剖技術は、実行が簡単で、標準的な実験装置を利用しているため、多くの人にとって堅牢でアクセスしやすい方法です。ニードルプラーを使用して、長さ4インチ、外径1.2ミリメートルの標準ガラスキャピラリーを注射針の形に引っ張ることから始めます。
少なくとも5つの50および100マイクロメートルのマイクロキャピラリーピペットを準備します。マイクロフォージを使用して、5倍対物レンズの下のマイクロフォージ接眼定規で示されているように、それぞれ3または5の目盛りにチェックマークを付けて、マイクロキャピラリーピペットを50マイクロメートルまたは100マイクロメートルに鍛造します。次に、マイクロキャピラリーピペットを口内吸引器チューブに貼り付けます。
直径35ミリメートルの滅菌ペトリ皿にM9を2ミリリットル、もう片方の直径35ミリの滅菌シャーレに2ミリリットルの解剖バッファーを加えて、M9浴1つと解剖バッファー浴を1つ用意します。最後に、100マイクロリットルの作業ウシ血清アルブミンまたはBSA溶液を各浴に加え、旋回させて混合します。解剖アレイを調製するために、150マイクロリットルの作業用レバミゾール溶液を2つのウェル凹スライドの第1のウェルに加え、150マイクロリットルの解剖バッファーを第2のウェルに加える。
各ウェルに20マイクロリットルの作業用BSA溶液を加えます。カエノラブディティスエレガンスCL2122ワーム腸を手で解剖するには、ワームピックを使用して線虫増殖培地またはNGMプレートからM9バスに20匹の成虫を移動します。次に、20匹のワームすべてをM9バスから解剖バッファーバスに移動します。
次に、10匹のワームのバッチを解剖バッファーバスからレバミゾール溶液を含むウェルに移動します。ワームの動きが遅くなったら、それらをレバミゾールウェルから解剖バッファーを含むウェルにすばやく移動します。解剖を開始する前に、ワームが解剖バッファー内で少し動き始めるのを待ちます。
蛍光解剖スコープの下で、皮下注射針を使用して咽頭のすぐ後ろまたは直腸の前で1つ切り込み、腸の前半分と後半分の中央を同数にします。腸が体から最大限に押し出されるまで約1分間待っている間に、RNA分解を減らすために50マイクロリットルのキレートバッファーをウェルに追加します。腸の押し出しを容易にするために、マウスアスピレーターに取り付けられた100マイクロメートルのマイクロキャピラリーピペットを使用し、ワームをピペットに出し入れします。
腸が十分に押し出されたら、27ゲージの皮下注射針を使用して、体の他の部分と残っている生殖腺から腸を切り取ります。マイクロキャピラリーピペットを使用して腸管切片を吸引し、核酸分離試薬が入ったマイクロ遠心チューブに移します。隔離した腸を氷の上に保ち、残りの腸に対して手順を繰り返します。
この方法は、腸の解剖と分離の成功を実証しました。この方法はまた、単離された腸からのRNA単離および微生物監視を報告した。CL2122線虫はGFPに融合した腸特異的金属2つのプロモーターを宿していたため、蛍光解剖スコープ下で腸が緑色の輝きとして観察されました。
成虫の解剖では,咽頭すぐ後ろを一次切開した後,腸が押し出された.腸管セグメントの解剖の成功は、生殖腺や死骸からの破片などの目に見える汚染物質がないように見えました。対照的に、解剖に失敗したのは、腸のセグメントに付着した生殖腺と死骸を示しました。
手の解剖によるRNA収量は、60個の腸切片の最終サンプルから約15ナノグラムの高品質の全RNAが得られるため、より効率的でした。腸細胞の線虫の分離とFACSの分離は、相応の量の総RNAを得るために数十万の腸細胞を必要とするため、効率が悪かった。汎細菌検出アッセイを使用した全微生物ゲノムDNA増幅は、前部、中部、および中部後部からの40の合計腸切片の最終サンプルが、約0.009ピコグラムの総微生物DNAの少ないが検出可能な量をもたらしたことを示しました。
この手順を実行する際に覚えておくべき最も重要なことは、解剖前にワームを過剰に麻痺させないことであり、これは最大の腸の押し出しを阻害する可能性があるためです。
