Denne model stimulerer biomekaniske stimuli, der opleves af glatte muskelceller i human aorta. Kombineret med patientafledte celler kan dette system bruges til lægemiddelscreening og personlig medicin af aortasygdomme. Denne model kan efterligne og præcist kontrollere de nøgne mekaniske parametre for de glatte muskelceller i human aorta, hvilket giver en ny in vitro-platform til undersøgelse og patogenese af aortasygdomme.
Mieradilijiang Abudubat, en plakatlæge fra vores laboratorium, demonstrerer proceduren. Begynd med at vaske den højre laterale region af den stigende aorta med sterile pbs, en eller to gange. Fjern intima og en adventitia lag af vævet med to oftalmiske tang og behold medielaget for at høste cellerne.
Placer medielaget på en 10 centimeter skål og skær den i to til tre millimeter stykker. Derefter tilsættes fem milliliter SMCM indeholdende 10% fbs og 1% penicillin streptomycin til vævsprøverne. Flyt det lille væv ind i kulturflasken med en steril dråber, og spred vævet jævnt.
Kassér kulturmediet så meget som muligt. Vend derefter flasken på hovedet. Tilsæt to milliliter SMCM i den omvendte kulturflaske og læg den i inkubatoren med 5% kuldioxid ved 37 grader Celsius i en til to timer.
Drej den derefter langsomt med højre side opad og tilsæt yderligere to milliliter SMCM. Efter fem til syv dages inkubation udveksles SMCM med fire ml frisk SMCM. Kassér langsomt og tilføj SMCM, når du skifter medie.
Generelt klatrer sporadiske glatte muskelceller ud om cirka to uger. Transporter kulturflasken forsigtigt, når du flytter til en mikroskopstation. Ellers vil vævene flyde, og cellerne vil vokse langsomt.
Når cellerne er vokset, opdeles de i to nye kulturflasker med fire milliliter frisk SMCM. Identificer cellerne gennem en immunfluorescensanalyse af fire specifikke markører for glatte muskelceller. For at polymerisere PDMS tilsættes hærdningsmidlet eller B-komponenten til basen eller A-komponenten og blandes komplekset i fem minutter.
Volumenet afhænger af undersøgelsens behov. Anbring den tilberedte PDMS-gel i en vakuumudsugningstank i 30 til 60 minutter, og hold trykket under negative 0,8 milli pascal. Brug computerstøttet designsoftware til at designe formen.
Specialfremstiller formene i de tre lag ved hjælp af en højpræcisionscomputer numerisk kontrolgraveringsmaskine. Efter udskæring af rammen af formene og mikrokanalerne ved hjælp af PMMA-plader, lim dem på en anden plade. Hæld den tilberedte PDMS-gel på en designet form.
Derefter krydsbindes ved 70 grader Celsius i en til to timer. Skræl de tværbundne PDMS-plader af formen og skær de kommercialiserede PDMS-membraner i sektioner på 100 millimeter gange 40 millimeter. Stans huller på de tre PDM'er plader ved hjælp af en en millimeter hul puncher til at gøre indløb og udløb af luft og mellemstore mikrokanaler på PDMS chip.
Behandl de tre forberedte PDMS-plader og to PDMS-membraner med iltplasma i fem minutter til PDMs overfladeaktivering. Indstil rumluften til at behandle gas, trykket til negative 100 kilopascal , strøm til 180 til 200 milliamp moler, spænding til 200 volt og behandlingstiden til fem minutter. Bond tre PDMS-plader og to PDMS-membraner sammen under et stereoskopisk mikroskop, således at det øverste lag består af luftkanalens PDMS-plade og derefter PDMS-membranen.
Mellemkanalen består af PDMS-pladen, derefter PDM-membranen, og bundlaget er luftkanalens PDMS-plade. Placer den samlede PDMS-chip i en 70 graders Celsius inkubator i en time. Forbered flere en millimeter indvendig diameter og tre centimeter længde latexslanger.
Indsæt en en millimeter ydre diameter og en centimeter lang nål i rustfrit stål i den ene ende af den forberedte slange. Indsæt derefter et lokkemiddel i den anden ende af slangen for at skabe røret, der er forbundet med PDMS-chippens luft og mellemstore mikrokanaler. Indsæt de forberedte rør i udløb og indløb af luften og mellemstore mikrokanaler på PDMS-chippen.
Tilsæt to milliliter 80 milligram pr. milliliter musekollagen i PDM-chippens mellemstore mikrokanal ved hjælp af en to milliliter sprøjte, og inkuber ved stuetemperatur i 30 minutter. Efter inkubation fjernes kollagenet fra kanalen med en to milliliter sprøjte. Placer de kollagenkodede PDMS-chips i en 60 graders Celsius-inkubator natten over.
Anbring PDMS-chipsene i en UV-sterilisator i mere end en time. Placer de steriliserede PDMS-chips på en ultra ren bænk som forberedelse til celleeksperimentet. Kultur fire gange 10 til de fem primære humane aorta glatte muskelceller fra patienter, der bruger SMCM indeholdende 2% FBS og 1% penicillin streptomycin i en 5% kuldioxidinkubator, indstillet til 37 grader celsius.
Når den glatte muskelcelletæthed når 80%, kasseres SMCM, og vask cellerne med to milliliter PPS. Fordøje cellerne ved hjælp af en milliliter 0,25% tripsin i to minutter og centrifuge ved 100 RCF i fem minutter. Fjern supernatanten og suspender cellepelleten i en milliliter frisk SMCM.
Brug otte milliliter SMCM til at dyrke cellerne på en 10 centimeter kulturskål. Ved hjælp af et cytometer beregnes cellenummeret og fortsættes med den endelige koncentration på to gange 10 til de fem celler pr. Milliliter. Hæld langsomt to milliliter PBS i den kollagenkodede og steriliserede PDMS-chipmediummikrokanal og kasseres senere ved hjælp af en to milliliter sprøjte.
Hæld langsomt to milliliter af to gange 10 til de fem celler pr. milliliter glat muskelcellesuspension i PDMS-chippens mediemikrokanal. Luk derefter lokket ved indgangen og udgangen af PDMS-chippen. Placer PDMS-chippen i en inkubator, indstillet til 37 grader celsius med 5% kuldioxid i en dag.
Efter inkubation, når cellerne er fastgjort til PDMS-membranen i PDMS-chippen, skal du forbinde udløbet af luftmikrokanalen på PDMS-chippen til vakuumstyringssystemet. En langstrakt normal cellulær form vil blive set under mikroskopet, når cellen er fastgjort. I modsætning til de suspenderede runde celler.
Tænd magnetventilen og vakuumpumpen. Åbn vakuumregulatoren, og juster trykniveauet afhængigt af stammerne. Placer derefter PDMS-chipsene og en inkubator indstillet til 37 grader celsius med 5% kuldioxid i 24 timer.
Forbered flere magnetventiler, vakuumfiltre, vakuumregulatorer, en vakuumpumpe, en peristaltisk pumpe og en PLC, der styrer magnetventilen. Programmer PLC-controlleren, og indstil tænd fra-tidsintervallet til en hertz. Tilslut magnetventilerne til den programmerede controller.
Tilslut vakuumpumpens indløb til vakuumfiltrene, og tilslut derefter vakuumfiltrenes udløb til vakuumregulatorerne. Tilslut vakuumregulatorernes udløb til magnetventiler. Og til sidst skal du forbinde udløbet af magnetventilerne til udløbene af PDMS-chipsens luftmikrokanaler.
Tilslut udløbet af den peristaltiske pumpe til indløbet af PDMS-chippens mellemstore mikrokanal og indløbet af den peristaltiske pumpe til udløbet af den mellemstore mikrokanal PDMS-chip til udskiftning af kulturmedium og lægemiddelhåndtering. Juster amplituden af belastningen af regulatoren og belastningsfrekvensen af mikrocontrolleren. Levedygtigheden af den humane aorta glatte muskelcellelinje, CRL 1990, i PDMS-chippen, blev estimeret ved hjælp af et levende og dødt assay på den tredje og femte dag af cellekulturen.
Cellelevedygtigheden blev fundet højere end 90% på dag tre og dag fem. Cytoskelet F-actin farvning af CRL 1990, i PDMS chip, viste normal cellemorfologi og celler justeret vinkelret på stammen efter strækning i 24 timer. Immunfluorescensen af de kontraktile markører SM22 og CNN1 var højere under belastningsforhold sammenlignet med de statiske tilstande.
Også SM22- og CNN1-generne blev opreguleret under belastningsforhold for glatte muskelceller. F-actinfarvningen af BAV og TAV, thoraxaortaaneurisme og dissektion af patientafledte primære humane aortaglatte muskelceller viste normal cellemorfologi og celler justeret vinkelret på belastningsretningen efter strækning i 24 timer. SM22- og CNN1-fluorescensen i BAVTAAD og TAV thoraxaortaaneurisme og dissektion var højere under belastningsforhold end under statiske forhold.
Svarende til genekspressionsniveauerne for SM22 og CNN1, som også blev opreguleret under belastningsforhold sammenlignet med statiske forhold. Der skal tages hensyn til sterilitetsprincippet ved isolering af primær HASMC. Efter at PDMS-laboratorierne og membranerne er behandlet med plasma, bør overfladerne ikke være snavsede.
Baseret på denne protokol kan endotelceller samdyrkes med glatte muskelceller, og den rene stress kan gives til cellerne med cyklisk belastning for yderligere at simulere flere mekaniske kræfter.