Name: a standardized liquid biopsy preanalytical protocol for downstream circulating-free dna applications
Uploaded: 2022-09-16T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Standardized Liquid Biopsy Preanalytical Protocol for Downstream Circulating-Free DNA Applications at JoVE.com

Kanserde Biyomedikal Araştırma Ağı'na (CIBERONC) destekleri ve aşağıdaki proje hibeleri için teşekkür ederiz: LB CIBERONC PLATFORM: CIBERONC sıvı biyopsisinin standardizasyonu ve teşviki için platform. PI Rodrigo Toledo, (CIBERONC), 2019-2021.

Kan örneklerinin çıkarılmasından önce katılımcı merkezlerden önceden etik onay alınmıştır. Serum ve plazma izolasyonu için aşağıdaki protokoller biyomedikal araştırmalar için etik ilkelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
NOT: Protokole başlamadan önce dikkat edilmesi gereken hususlar burada verilmiştir. İnsan örneklerinin biyomedikal araştırmalarda kullanımı için, ilgili bilgilendirilmiş onam ile önceden etik onay gereklidir. Kan örneklerini işlemek iç...

<ol>
	<li>Alix-Panabi&#232;res, C., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+applications+of+circulating+tumor+cells+and+circulating+tumor+DNA+as+liquid+biopsy.">Clinical applications of circulating tumor cells and circulating tumor DNA as liquid biopsy.</a> Cancer Discovery. 6 (5), 479-491 (2016).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+exosomes+as+liquid+biopsy+in+clinical+diagnosis.">Application of exosomes as liquid biopsy in clinical diagnosis.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 144 (2020).</li><li>Bettegowda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsies:+Genotyping+circulating+tumor+DNA.">Liquid biopsies: Genotyping circulating tumor DNA.</a> Nature Medicine. 4 (6), (2014).</li><li>Heitzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+a+practical+implementation+of+circulating+tumor+DNA+mutation+testing+in+metastatic+non-small-cell+lung+cancer.">Recommendations for a practical implementation of circulating tumor DNA mutation testing in metastatic non-small-cell lung cancer.</a> ESMO Open. 7 (2), 100399 (2022).</li><li>Gennari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESMO+Clinical+Practice+Guideline+for+the+diagnosis,+staging+and+treatment+of+patients+with+metastatic+breast+cancer.">ESMO Clinical Practice Guideline for the diagnosis, staging and treatment of patients with metastatic breast cancer.</a> Annals of Oncology: Official Journal of the European Society for Medical Oncology. 32 (12), 1475-1495 (2021).</li><li>Van Buren, T., Arwatz, G., Smits, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+monitor+hemolysis+in+real+time.">A simple method to monitor hemolysis in real time.</a> Scientific Reports. 10 (1), 5101 (2020).</li><li>Ignatiadis, M., Sledge, G. W., Jeffrey, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsy+enters+the+clinic+-+implementation+issues+and+future+challenges.">Liquid biopsy enters the clinic - implementation issues and future challenges.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 18 (5), 297-312 (2021).</li><li>Sidstedt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+mechanisms+of+hemoglobin,+immunoglobulin+G,+and+whole+blood+in+digital+and+real-time+PCR.">Inhibition mechanisms of hemoglobin, immunoglobulin G, and whole blood in digital and real-time PCR.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (10), 2569-2583 (2018).</li><li>Maass, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+sampling+to+sequencing:+A+liquid+biopsy+pre-analytic+workflow+to+maximize+multi-layer+genomic+information+from+a+single+tube.">From sampling to sequencing: A liquid biopsy pre-analytic workflow to maximize multi-layer genomic information from a single tube.</a> Cancers. 13 (12), 3002 (2021).</li><li>Greytak, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harmonizing+cell-free+DNA+collection+and+processing+practices+through+evidence-based+guidance.">Harmonizing cell-free DNA collection and processing practices through evidence-based guidance.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 26 (13), 3104-3109 (2020).</li><li>Trigg, R. M., Martinson, L. J., Parpart-Li, S., Shaw, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+that+influence+quality+and+yield+of+circulating-free+DNA:+A+systematic+review+of+the+methodology+literature.">Factors that influence quality and yield of circulating-free DNA: A systematic review of the methodology literature.</a> Heliyon. 4 (7), 00699 (2018).</li><li>Boissier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+centrifuge+brake+impacts+neither+routine+coagulation+assays+nor+platelet+count+in+platelet-poor+plasma.">The centrifuge brake impacts neither routine coagulation assays nor platelet count in platelet-poor plasma.</a> Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 58 (9), 185-188 (2020).</li><li>Johansson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+and+quality+controls+when+analyzing+cell-free+tumor+DNA.">Considerations and quality controls when analyzing cell-free tumor DNA.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 17, 100078 (2019).</li><li>Casas-Arozamena, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+profiling+of+uterine+aspirates+and+cfDNA+as+an+integrative+liquid+biopsy+strategy+in+endometrial+cancer.">Genomic profiling of uterine aspirates and cfDNA as an integrative liquid biopsy strategy in endometrial cancer.</a> Journal of Clinical Medicine. 9 (2), 585 (2020).</li><li>Alcoceba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsy:+a+non-invasive+approach+for+Hodgkin+lymphoma+genotyping.">Liquid biopsy: a non-invasive approach for Hodgkin lymphoma genotyping.</a> British Journal of Haematology. 195 (4), 542-551 (2021).</li><li>Szpechcinski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+DNA+levels+in+plasma+of+patients+with+non-small-cell+lung+cancer+and+inflammatory+lung+disease.">Cell-free DNA levels in plasma of patients with non-small-cell lung cancer and inflammatory lung disease.</a> British Journal of Cancer. 113 (3), 476-483 (2015).</li><li>Earl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutation+profiling+in+the+liquid+biopsy+and+clinical+analysis+of+hereditary+and+familial+pancreatic+cancer+cases+reveals+kras+negativity+and+a+longer+overall+survival.">Somatic mutation profiling in the liquid biopsy and clinical analysis of hereditary and familial pancreatic cancer cases reveals kras negativity and a longer overall survival.</a> Cancers. 13 (7), 1612 (2021).</li><li>Lampignano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicenter+evaluation+of+circulating+cell-free+DNA+extraction+and+downstream+analyses+for+the+development+of+standardized+(pre)analytical+work+flows.">Multicenter evaluation of circulating cell-free DNA extraction and downstream analyses for the development of standardized (pre)analytical work flows.</a> Clinical Chemistry. 66 (1), 149-160 (2020).</li><li>Febbo, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+technical+data+elements+for+liquid+biopsy+data+submitted+to+public+databases.">Minimum technical data elements for liquid biopsy data submitted to public databases.</a> Clinical Pharmacology and Therapeutics. 107 (4), 730-734 (2020).</li><li>De Mattos-Arruda, L., Siravegna, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+use+liquid+biopsies+to+treat+patients+with+cancer.">How to use liquid biopsies to treat patients with cancer.</a> ESMO Open. 6 (2), 100060 (2021).</li></ol>

Sıvı biyopsi, kanser yönetimi sırasında farklı zamanlarda çok sayıda potansiyel uygulamaya sahiptir. İlk olarak, tanıda, klinik olarak daha fazla araştırılabilecek potansiyel bir tümör lezyonunun varlığını düşündürecek tümör moleküler belirteçlerini tanımlamak. İkincisi, hastalığın gerçek zamanlı izlenmesi için tedavi sırasında, tedavi moleküler yanıtının değerlendirilmesi, klonal evrim ve hastalık nükslerinin veya tedavi direncinin erken tespiti. Son olarak, cerrahi tedaviden ...

"Sıvı biyopsi" terimi 2010 yılında1 birincil tümörden kaynaklanan kan ve diğer vücut sıvılarında moleküllerin (örneğin, protein, deoksiribonükleik asit (DNA), ribonükleik asit (RNA)), hücrelerin veya hücre dışı veziküllerin (örneğin, eksozomlar) varlığı olarak tanımlanmıştır. Sıvı biyopsi örneklerinin kullanımı, translasyonel onkoloji araştırmalarında devrim yaratmıştır, çünkü belirli bir anda belirli bir bölgeyle sınırlı olan doku biyopsileri, tümör heterojenliği nedeniyle ilgili klonları kaçırabilir. Ek olarak, sıvı biyopsi, primer dokunun az olduğu veya erişilemediği tümör tiplerinde ilgili bir rol oynar, çünkü invaziv bir biyopsiden kaçınabilir, hastalar için maliyetleri ve riski azaltabilir. Ayrıca, tümörün moleküler özellikleri esas olarak tedavi baskısı nedeniyle sürekli olarak gelişmektedir ve sıvı biyopsi örnekleri, tümör klonal dinamiklerini, hastalığın başlangıç, tedavi, en iyi yanıt ve hatta daha önce olduğu gibi hastalığın farklı klinik ve terapötik zamanlarında uzunlamasına alınabildikleri için yakalayabilir. "Gerçek zamanlı sıvı biyopsisi" kavramı, tümördeki dinamik değişikliklerin gerçek zamanlı olarak izlenebileceği ve böylece bu hastalıkta hassas tıbba izin verilebileceği anlamına gelir. Sıvı biyopsi, kanserin taranması ve erken teşhisi, hastalığın gerçek zamanlı izlenmesi, minimal kalıntı hastalığın tespiti, tedavi direnci için mekanizmaların incelenmesi ve hastaların terapötik düzeydesınıflandırılması dahil olmak üzere klinikte çok sayıda potansiyel uygulamaya sahiptir. Hastalığın nüksünün ve progresyonunun erken saptanması birçok tümör tipinde karşılanmamış bir klinik ihtiyaçtır ve kanser hastalarının sağkalımını ve yaşam kalitesini arttırmada anahtar faktördür. Rutin görüntüleme yöntemleri ve çözünür tümör belirteçleri bu görev için gereken duyarlılık ve/veya özgüllükten yoksun olabilir. Bu nedenle, klinikte, dolaşımdaki serbest nükleik asitlere dayananlar gibi yeni prediktif belirteçlere acilen ihtiyaç duyulmaktadır.
Sıvı biyopsi çalışmaları için kullanılan örnek türleri kan, idrar, tükürük ve dışkı örneklerini içerir, ancak bunlarla sınırlı değildir. Diğer tümöre özgü örnekler hücre aspiratları, beyin omurilik sıvısı, plevral sıvı, kist ve asit sıvısı, balgam ve pankreas suyu2 olabilir. Eski sıvılar, farklı tipte kanserden türetilmiş materyaller, dolaşımdaki tümör hücreleri (CTC) veya eksozomlar ve hücresiz dolaşımdaki tümör DNA'sı (ctDNA) gibi fragmanlar içerebilir. Nükleik asitler hücre dışı veziküllerde (EV'ler) kapsüllenebilir veya hücre ölümü ve hasarı nedeniyle vücut sıvılarına salınabilir. Dolaşımdaki serbest DNA (cfDNA) esas olarak apoptotik veya nekrotik hücrelerden kan dolaşımına salınır ve tüm bireylerde bulunur, enflamatuar veya onkolojik hastalıklarda artmış seviyeler gösterir3. Eksozomlar, nükleik asitler, proteinler ve lipitler içeren hücreler tarafından salgılanan küçük hücre dışı veziküllerdir (~ 30-150 nm). Bu veziküller hücreler arası iletişim ağının bir parçasını oluşturur ve birçok vücut sıvısı türünde yaygın olarak bulunur2. EV'lerin içindeki nükleik asitler, vücut sıvıları içindeki sert ortamdan korunur, böylece bu molekülleri sıvı biyopsi ortamında incelemek için daha sağlam bir yol sağlar.
Genel olarak, sıvı biyopsi örneklerinde dolaşımdaki nükleik asit seviyeleri çok düşüktür ve bu nedenle dijital PCR veya yeni nesil dizileme (NGS) gibi algılama için hassas yöntemlere ihtiyaç vardır. Numunenin preanalitik yönetimi, kan hücresi lizisini ve bozulmamış DNA'nın salınmasını önlemek için çok önemlidir, bu da cfDNA'nın genomik DNA ile kontaminasyonuna neden olur. Ayrıca, enzim bazlı analiz yöntemlerinin inhibitörlerinin varlığından kaçınmak için numuneler çıkarılırken dikkatli olunmalıdır.
Burada, dolaşımdaki nükleik asit analizleri de dahil olmak üzere sıvı biyopsi bazlı aşağı akış uygulamaları için çok önemli bir ilk adım olan plazma ve serum örneklerinin toplanması ve depolanması için standartlaştırılmış bir yöntem sunuyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.086</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological disposable pipettes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>GSP010010</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Vacutainer K2 EDTA tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367525</td>
			<td>These tubes can be used for plasma collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT411150</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>368965</td>
			<td>Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mL polypropylene cryogenic vial, round bottom, self-standing</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430662</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mL Vacutainer K2 EDTA tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367864</td>
			<td>These tubes can be used for plasma collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4200 TapeStation System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991BA</td>
			<td>Several quantification methods are available with a&#160; specific application for cfDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological disposable pipettes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>GSP010005</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366468</td>
			<td>Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, capable of ~3000 x g with a swing bucket rotor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Sorvall ST 16 &#160;10688725</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer storage boxes for 1&#8211;4 mLcryogenic vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431120</td>
			<td>These boxes are needed when using 4 mL vials for storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 pipette tips</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>4809</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>55114</td>
			<td>Any commercially available kit that is specific for cfDNA isolation can be used with this blood prcessing protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streck&#160;Cell-Free DNA BCT CE tubes 10 mL</td>
			<td>Streck</td>
			<td>218997</td>
			<td>These tubes can be used for plasma collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Freezer (-80 &#176;C)</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>2180104</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a standardized liquid biopsy preanalytical protocol for downstream circulating-free dna applications

Sıvı biyopsisi (LB) terimi, birincil ve / veya metastatik tümörden kaynaklanan kan ve diğer vücut sıvılarındaki proteinler, DNA, RNA, hücreler veya hücre dışı veziküller gibi molekülleri ifade eder. LB, translasyonel araştırmalarda bir dayanak noktası olarak ortaya çıkmış ve solid biyopsiye minimal invaziv bir alternatif sunarak klinik onkoloji uygulamasının bir parçası haline gelmeye başlamıştır. LB, kan gibi minimal invaziv bir numune ekstraksiyonu yoluyla bir tümörün gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar. Uygulamalar arasında erken kanser tespiti, hastalık progresyonunun tespiti için hasta takibi, minimal rezidüel hastalığın değerlendirilmesi ve moleküler progresyon ve direnç mekanizmasının potansiyel olarak tanımlanması yer almaktadır. Klinikte rapor edilebilen bu örneklerin güvenilir bir analizini elde etmek için, preanalitik prosedürler dikkatlice düşünülmeli ve kesinlikle takip edilmelidir. Örnek toplama, kalite ve depolama, aşağı akış uygulamalarında kullanışlılıklarını belirleyen önemli adımlardır. Burada, dolaşımda olmayan DNA'ya dayalı aşağı akış sıvı biyopsi analizi için plazma ve serum örneklerinin toplanması, işlenmesi ve depolanması için sıvı biyopsi çalışma modülümüzden standartlaştırılmış protokoller sunuyoruz. Burada sunulan protokoller standart ekipman gerektirir ve biyolojik prosedürlere odaklanan çoğu laboratuvarda uygulanacak kadar esnektir.

Antikoagülan olmadan kan tüplerinin santrifüjlenmesinden sonra, üst faz soluk sarı renkte görünür ve serum fraksiyonuna karşılık gelir (Şekil 2). Bu fraksiyon dikkatlice çıkarılır ve sonraki analizler için aliquoted edilir.
Hemoliz, plazma veya serum fraksiyonunda mevcut olabilir ve üst faz, hemolizin varlığını ve derecesini gösteren kırmızımsı bir görünüme sahip olacaktır (Şekil 3).
<p class="jove_...

Watch this Scientific Journal Video about A Standardized Liquid Biopsy Preanalytical Protocol for Downstream Circulating-Free DNA Applications at JoVE.com

A Standardized Liquid Biopsy Preanalytical Protocol for Downstream Circulating-Free DNA Applications

Sıvı biyopsi, onkoloji translasyonel çalışmalarına yaklaşımımızda devrim yarattı ve örnek toplama, kalite ve depolama, başarılı klinik uygulaması için çok önemli adımlardı. Burada, çoğu translasyonel araştırma laboratuvarında uygulanabilecek aşağı akış dolaşımsız DNA uygulamaları için standartlaştırılmış ve doğrulanmış bir protokolü açıklıyoruz.

Aşağı Akış Dolaşımsız DNA Uygulamaları için Standartlaştırılmış Bir Sıvı Biyopsi Preanalitik Protokolü

The term liquid biopsy (LB) refers to molecules such as proteins, DNA, RNA, cells, or extracellular vesicles in blood and other bodily fluids that ...

Bu, dolaşımdaki serbest DNA'ya dayanan aşağı akış sıvı biyopsi uygulamaları için kan örneklerinin işlenmesi ve depolanması için standart bir protokoldür. Bu, teknik birkaç yıldır kullanılmasına rağmen, yayınlanan ilk standart protokoldür. Çoğu çeviri veya bilimsel laboratuvarda bulunan standart ekipmanlarla takip etmek kolaydır.Protokol tüm laboratuvar personeli tarafından gerçekleştirilebilir. Protokol, numuneleri toplama ve saklama şeklimizi standartlaştırmaya yardımcı olur, bu da sonuçta klinikte etki yaratacak ve hassasiyetin en önemli olduğu aynı veya benzer aşağı akış analizini gerçekleştiren farklı merkezler arasındaki değişkenliği azaltacaktır. Bu yöntem özellikle onkoloji araştırmalarında ve klinik uygulamalarda yararlıdır.Bununla birlikte, sıvı biyopsisinin de kullanıldığı diğer kanser dışı hastalıklarda da uygulanabilir. Kan örneği santrifüj edildikten sonra, ne kadar plazma veya serumun çıkarılacağını bilmek zor olabilir, ancak bu özel yönergeleri takip etmek bu konuda yardımcı olacaktır. Protokolün geri kalanını laboratuvarda sınırlı deneyimle takip etmek çok kolaydır.Prosedürü gösteren, laboratuvarımızdan bir teknisyen olan Jorge olacaktır. Başlamak için, oda sıcaklığında taze kan içeren tüpü, maksimum mola uygulanarak, 1600 kez g'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın. Tüpü santrifüjden dikkatlice çıkarın.Serum süpernatantının üst fazı berrak ve sarımsı görünecektir. Numunenin hemoliz belirtileri gösterip göstermediğini kontrol edin ve uygun olduğunda hemoliz varlığını kaydedin. Sınıf II biyogüvenlik kabininde, serumu toplama tüplerine 250 mikrolitrelik alikotlar olarak aktarın.Aliquots doğru etiketlenmelidir. Serumu hemen saklama kutusunda eksi 80 santigrat derecede dik olarak dondurun ve numune depolama süresini kaydedin. Örneklerin gerekli dört saatlik zaman dilimi içinde işlendiğini doğrulayın.EDTA tüpünü oda sıcaklığında 1600 kez g'de 10 dakika boyunca santrifüj edin, maksimum mola uygulanır. Santrifüjlemeden sonra, plazma süpernatantı berrak ve sarımsı görünecektir. Numunenin hemoliz belirtileri gösterip göstermediğini kontrol edin ve plazmayı tek kullanımlık bir serolojik pipet kullanarak hücresel tabakayı rahatsız etmeden 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.Hücre tabakasının üzerinde yaklaşık beş milimetrede küçük bir plazma kalıntısı hacmi bırakın. Hemoliz gözlenirse, daha fazla analiz için numuneyi atın. İlk santrifüjleme adımından taşınan artık sağlam kan hücrelerini çıkarmak için plazmayı ve 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünü santrifüj yapın.Tüpün altındaki hücre peletini değil, tüpü santrifüjden dikkatlice çıkarın ve tek kullanımlık bir serolojik pipet kullanarak bir ila dört mililitre polipropilen kriyojenik bios veya Eppendorfs'a bir ila dört mililitre plazma aktarın. Plazmanın kan hücreleri ile kirlenmesini önlemek için tüpün dibinde artık bir plazma hacmi bırakılmalıdır. Plazmayı hemen saklama kutusunda eksi 80 santigrat derecede dik olarak dondurun ve numune depolama süresini kaydedin.Numunelerin doğru şekilde etiketlendiğini ve gerekli dört saatlik zaman dilimi içinde işlendiğini doğrulayın. Bir P1000 ve filtrelenmiş uç kullanarak hücresel tabakayı toplayın ve iki mililitrelik bir tüpe aktarın. Hemen dondurun ve eksi 80 santigrat derecede saklayın.Aşağı akış uygulamaları için kullanılabilecek yüksek kaliteli cfDNA ekstraksiyonunun bir örneği burada gösterilirken, bu grafik görüntü yüksek düzeyde genomik kontaminasyona sahip uygun olmayan bir numunenin bir örneğini temsil etmektedir. Plazma veya serum fraksiyonu sarı renkte olmalıdır. Bu, bireysel örneğe bağlı olarak değişebilir.Hemolizli örnekler atılmalıdır. Plazma fraksiyonunu çıkarırken herhangi bir hücre peletini çıkarmamaya dikkat edin. Bu protokol, immün tespit teknikleri kullanılarak serum ve plazma örneklerinde kodlanamayan RNA'ların veya proteinlerin tespiti gibi diğer nükleik asit bazlı ve protein uygulamaları için de kullanılabilir.Bu, birçok laboratuvarda kullanılan çok standart bir tekniktir. Bu protokol, araştırmacıların analizimizi nasıl yaptığımızı standartlaştırmalarına yardımcı olur, çünkü bu, gelecekteki klinik uygulamalar için gerekli olan çok önemli bir husustur.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Diffüz İçsel Pontine Glioma Hızlı post-mortem Hücre Kültürü için Protokol (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier (MSC) for Lung Cancer Screening

MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier MSC for Lung Cancer Screening

MikroRNA tabanlı sıvı biyopsi: Plazma miRNA imza Sınıflandırıcısı (MSC) akciğer kanseri süzmek için bir deneyim

The development of a minimally invasive test, such as liquid biopsy, for early lung cancer detection in its preclinical phase is crucial to improve the ...

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Hedef hücre ön zenginleştirme ve tüm genom amplifikasyon tek hücre aşağı akım karakterizasyonu için

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Yukarı doğru hareket: Bir basit ve esnek Vitro üç boyutlu işgali tahlil iletişim kuralı

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

DNA onarım işlemleri, Darbe Gerilimlerinden ve uzun süreli iki iplikçikli DNA sonları ayirt mikroskobu ile karakterize

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Evaluation of the Feasibility, Safety, and Accuracy of an Intraoperative High-intensity Focused Ultrasound Device for Treating Liver Metastases

Fizibilite, Emanet ve intraoperatif bir yoğun doğruluğunu karaciğer metastaz tedavisi için ultrason cihazı odaklı

Today, the only potentially curative option in patients with colorectal liver metastases is surgery. However, liver resection is feasible in less than 20% ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Invaziv cerrahi biyopsiye yanıt olarak beyin tümörü hücre davranışının boyuna Intravital görüntüleme

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Akım moleküler Analizi ve metastatik potansiyel değerlendirme için sirkülasyon tümör hücrelerinin mikromanipülasyon

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

İnsan Kolon Kanseri Hücrelerinde DNA Hasarı ve Onarım Foci İmmünofloresan Görüntüleme

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Automated Dissection Protocol for Tumor Enrichment in Low Tumor Content Tissues

Düşük Tümör İçeriği Dokularında Tümör Zenginleştirme için Otomatik Diseksiyon Protokolü

Tumor enrichment in low tumor content tissues, those below 20% tumor content depending on the method, is required to generate quality data reproducibly ...