Denne teknik bruger PET-billeddannelse til at belyse in vivo-fordelingen og dynamikken i B-celler i centralnervesystemet. Vores tilgang er gavnlig til at studere neurologiske sygdomme, hvor den berørte rygmarv gør analysen mere udfordrende. Så der er et par hovedfordele ved vores teknik.
For det første har vi skabt et nyt værktøj til at spore en pan B-cellebiomarkør, der giver os mulighed for at fange en række B-celleundergrupper og visualisere dem in vivo. For det andet muliggør vores rygmarvsanalysemetode meget nøjagtig og reproducerbar kvantificering af PET-signaler i denne region. Det fantastiske ved vores teknik er, at den er sygdomsagnostisk.
Det kan bruges fra præklinisk til klinisk PET-billeddannelse i ethvert scenarie, hvor B-celler og / eller rygmarven er af interesse. 18 til 24 timer efter radioaktiv mærkning og injektion af antistoffet i musen, forberede musen til scanning ved at anvende øjengel på øjnene. Sørg for, at scanningslejet med fire mus er udstyret med en varmepude med isofluran indstillet fra 1,5 til 2 %Placer musen i liggende stilling på scanningslejet, og træk forsigtigt i musehalen for at rette rygsøjlen.
Når musen er i liggende stilling, skal du tape den sikkert med blødt mikroskoptape over hovedet og maven for at minimere bevægelsen fra vejrtrækning. Lav en oversigt over scanningspositionen for hver mus i en laboratorienotesbog. Når du har sikret den første gruppe, skal du lukke sengen og kontrollere sengens placering ved at køre en CT-scanning.
Klik på CT Center Field of View, og når sengen er på plads, skal du køre CT-testscanningen for at sikre, at placeringen er korrekt. Gentag indtil sengens position er tilfredsstillende. Placer et lille hvidt bånd på scannersengen for at markere den korrekte sengeplacering for resten af undersøgelsen.
Åbn menuen Motion Controller, og klik på PET Center Field of View for at flytte musene ind i PET-ringen. Når sengen er i PET-ringen, skal du starte scanningssekvensen ved at klikke på Kør og vente på, at scanneren automatisk fuldfører PET-scanningen og flytte fra PET-ringen til CT-erhvervelsen. Siden eksperimentel autoimmun encephalomyelitis, eller EAE, har mus udtalt krumning af rygsøjlen på grund af sygdomsprogression, scanning af dem, mens de er på ryggen, hjælper med at rette rygsøjlen.
Lav et snit ned ad dyrets dorsale side, og fjern huden og pelsen for at udsætte rygsøjlen. Skær langs tre tværgående planer gennem rygsøjlen ved nakken, direkte under ribbenburet og øverst i bækkenet for at adskille lændehvirvelsøjlen fra livmoderhals- og thoraxområderne. Fjern forsigtigt den segmenterede rygsøjle for at få to stykker, lændehvirvel og cervikal thorax.
Isoler derefter lændehvirvelsøjlen ved omhyggeligt at trimme rygsøjlen fra bækkenenden, indtil lændehvirvelsøjlen er synlig. For at udstøde lændehvirvelsøjlen skal du bruge en slip-tip sprøjte fyldt med PBS og skabe en forsegling mellem sprøjten og rygsøjlen ved hjælp af tommel- og pegefinger. Skub forsigtigt PBS gennem sprøjten for at presse rygmarven ud på en absorberende pude, og gentag for cervikal thoraxrygmarv ved at indsætte sprøjten fra livmoderhalssiden.
Placer rygmarvsvævet i et gammatællerør. Optag tørvægten, og tilsæt PBS for at sikre, at vævet er i bunden af røret for at undgå tørring. Placer røret på is, indtil det er klar til tælling.
For at starte analysen af interesseområder i rygmarven skal du åbne 3D Region of Interest Tool fra navigationsmenuen. Under overskriften Interesseområder skal du bruge plustegnet nederst i menuen til at oprette seks interesseområder, interesseområde for lumbal, cervikal thoraxregion af interesse, lændeskelet, thoraxskelet, lændehvirvelrygmarv, thoraxrygmarv. For at undgå visuel interferens fra PET-signalet skal du klikke på F3 for at slukke for PET.
Gå til toppen af 3D Region of Interest Tool Operator, og klik på den udfyldte prik til højre for markørsymbolet for at åbne menuen 3D Paint Mode og Erode/Dilat. Vælg Sfære, og skift størrelsen til 20 pixel. På samme måde skal du indstille dilaten til plus fem.
Før du går videre, skal du gå til bunden af menuen og sikre, at lændehvirvelområdet af interesse er valgt. På CT finder du L6-hvirvlen i rygsøjlen. Start med en hvirvel over L6, tegn en grov lændehvirvelregion af interesse over de fem hvirvler over hofterne.
Skift derefter til cervikal thoraxregion af interesse, og spor resten af rygsøjlen til bunden af kraniet. Når du har tegnet de generaliserede interesseområder, skal du gå til toppen af operatøren og vælge menuen Segmenteringsalgoritmer. Fra rullemenuen skal du vælge Otsu-tærskelværdi, derefter vælge lænderegion af interesse for input, og sørg for, at lændeskelet er valgt nederst i menuen.
I rullemenuen ved siden af Billede skal du sikre dig, at CT-scanningen er valgt, angivet her med tallet nul. Klik på Anvend, og gentag proceduren for cervikal thoraxregion af interesse og thoraxskelet. Når du har brugt Otsu-tærskelværdier til at oprette de relevante skeletområder, skal du vende tilbage til navigationsmenuen og slette interesseområdet eller markere H-kolonnen for både de ru lændehvirvel- og livmoderhalsbrystområder af interesse for at skjule dem.
Marker I-kolonnen for begge skeletområder af interesse, så de ikke kan redigeres. Til sidst skal du vende tilbage til toppen af 3D Region of Interest Tool Operator og gå til menuen 3D Paint for at tegne de interessante rygmarvsområder. Vælg kugleværktøjet igen, og spor rygmarven i skelettet for både lændehvirvel og thorax, hvilket sikrer, at det korrekte interesseområde er valgt nederst i menuen.
For at slette enhver region af interesse skal du klikke på Kommando / kontrol og tegne over den del, der skal slettes. Kontroller rygmarvsregionen af interesse fra alle tre planer for at sikre, at der ikke trækkes nogen interesseområde uden for rygsøjlen. Hvis PET-signalet blev slukket, skal du trykke på F3, efter at de relevante rygmarvsområder er trukket for at tænde PET igen, eller vælge Visual Controller og klikke på PET-bjælken.
Gå tilbage til navigationsmenuen. Klik på gitterikonet for at vise tabellen. Kopier tabellen til regnearkssoftware, og gem filen.
PET-billeddannelse afslørede forhøjet radiosporbindingsbinding i hjernen og thorax rygmarven hos EAE-mus sammenlignet med de naive mus. Ex vivo gammatælling viste øget binding i både lændehvirvelsøjlen og cervikal thorax rygmarvssegmenter og hjernen hos EAE-mus sammenlignet med naive. Ex vivo autoradiografibilleder viste øget radiosporbinding i sagittale hjernesektioner, specifikt i hjernestammen, lillehjernen og ventriklerne hos EAE-mus sammenlignet med naive mus.
Tilsvarende blev der observeret en øget radiosporbindingsbinding i både cervikal thorax og lumbal rygmarvssegmentet hos EAE-mus sammenlignet med naive rygmarv. Efter PET-billeddannelse og gammatælling kan vi undersøge forholdet mellem PET-signal og målet af interesse gennem molekylærbiologiske teknikker, såsom flowcytometri og immunhistokemi. Vores teknik har banet vejen for forskere til at stille spørgsmål om B-cellernes in vivo-rolle i flere sygdomsområder, herunder slagtilfælde, multipel sklerose, andre autoimmune sygdomme og kræft.
