Deze techniek maakt gebruik van PET-beeldvorming om de in vivo distributie en dynamiek van B-cellen in het centrale zenuwstelsel op te helderen. Onze aanpak is gunstig voor het bestuderen van neurologische aandoeningen, waarbij het aangetaste ruggenmerg de analyse uitdagender maakt. Er zijn dus een paar belangrijke voordelen aan onze techniek.
Ten eerste hebben we een nieuwe tool gemaakt om een pan-B-celbiomarker te volgen waarmee we een reeks B-celsubsets kunnen vastleggen en in vivo kunnen visualiseren. Ten tweede maakt onze ruggenmerganalysemethode een zeer nauwkeurige en reproduceerbare kwantificering van PET-signalen in deze regio mogelijk. Het mooie van onze techniek is dat het ziekte-agnostisch is.
Het kan worden gebruikt van preklinische tot klinische PET-beeldvorming in elk scenario, waarbij B-cellen en/of het ruggenmerg van belang zijn. 18 tot 24 uur na het radioactief labelen en injecteren van het antilichaam in de muis, bereidt u de muis voor op scannen door ooggel op de ogen aan te brengen. Zorg ervoor dat het scanbed met vier muizen is uitgerust met een verwarmingskussen met isofluraan ingesteld van 1.5 tot 2%Plaats de muis in rugligging op het scanbed en trek voorzichtig aan de muisstaart om de ruggengraat recht te maken.
Zodra de muis in rugligging ligt, plakt u hem stevig vast met zachte microscooptape over het hoofd en de buik om de beweging van de ademhaling te minimaliseren. Noteer de scanpositie voor elke muis in een labnotitieboek. Nadat u de eerste groep hebt vastgezet, sluit u het bed en controleert u de plaatsing van het bed door een CT-scan uit te voeren.
Klik op CT Center Field of View en zodra het bed op zijn plaats staat, voert u de CT-testscan uit om er zeker van te zijn dat de plaatsing correct is. Herhaal dit totdat de bedpositie bevredigend is. Plak een kleine witte tape op het scannerbed om de juiste plaatsing van het bed voor de rest van het onderzoek te markeren.
Open het menu Motion Controller en klik op PET Center Field of View om de muizen in de PET-ring te verplaatsen. Zodra het bed zich in de PET-ring bevindt, start u de scanreeks door op Uitvoeren te klikken en wacht u tot de scanner de PET-scan automatisch voltooit en gaat u van de PET-ring naar de CT voor CT-acquisitie. Aangezien experimentele auto-immuun encefalomyelitis, of EAE, muizen een uitgesproken kromming van de wervelkolom hebben als gevolg van ziekteprogressie, helpt het scannen van hen terwijl ze op hun rug liggen om de wervelkolom recht te trekken.
Maak een incisie langs de dorsale zijde van het dier en verwijder de huid en vacht om de wervelkolom bloot te leggen. Snijd langs drie dwarsvlakken door de wervelkolom in de nek, direct onder de ribbenkast en aan de bovenkant van het bekken om de lumbale van de cervicale en thoracale regio's te scheiden. Verwijder voorzichtig de gesegmenteerde wervelkolom om twee stukken te krijgen, lumbale en cervicale thoracale.
Isoleer vervolgens de lumbale wervelkolom door de wervelkolom voorzichtig vanaf het bekkenuiteinde af te knippen totdat het lumbale ruggenmerg zichtbaar is. Om het lumbale ruggenmerg te verdrijven, gebruikt u een sliptipspuit gevuld met PBS en maakt u met duim en wijsvinger een afdichting tussen de spuit en de wervelkolom. Duw de PBS voorzichtig door de spuit om het ruggenmerg op een absorberend kussentje te verdrijven en herhaal dit voor het cervicale thoracale ruggenmerg door de spuit vanaf de cervicale zijde in te brengen.
Plaats de ruggenmergweefsels in een gammatelbuis. Noteer het drooggewicht en voeg PBS toe om ervoor te zorgen dat het weefsel zich op de bodem van de buis bevindt om uitdroging te voorkomen. Plaats de buis op ijs totdat hij klaar is om te tellen.
Als u wilt beginnen met de analyse van interessegebieden in het ruggenmerg, opent u de tool 3D-interessegebied in het navigatiemenu. Gebruik onder de kop Interessegebieden het plusteken onder aan het menu om zes interessegebieden te maken: lumbale interesseregio, cervicale thoracale interesseregio, lumbaal skelet, thoracaal skelet, lumbale ruggenmerg, thoracale ruggenmerg, thoracale ruggenmerg. Om visuele interferentie van het PET-signaal te voorkomen, klikt u op F3 om de PET uit te schakelen.
Ga naar de bovenkant van de 3D-operator voor interessegebieden en klik op de effen stip rechts van het cursorsymbool om de 3D-tekenmodus en het menu Erode/Dilate te openen. Selecteer Bol en wijzig de grootte in 20 pixels. Stel op dezelfde manier dilate in op plus vijf.
Voordat u verder gaat, gaat u naar de onderkant van het menu en zorgt u ervoor dat het lumbale gebied van belang is geselecteerd. Zoek op de CT de L6-wervel van de wervelkolom. Begin met één wervel boven L6 en teken een ruw lumbaal gebied dat van belang is over de vijf wervels boven de heupen.
Schakel vervolgens over naar het cervicale thoracale gebied van belang en traceer de rest van de wervelkolom naar de basis van de schedel. Nadat u de algemene interessegebieden hebt getekend, gaat u naar de bovenkant van de operator en selecteert u het menu Segmentatie-algoritmen. Selecteer in het vervolgkeuzemenu Otsu-drempels, selecteer vervolgens het lumbale gebied dat van belang is voor de invoer en zorg ervoor dat het lumbaal skelet onder aan het menu wordt gekozen.
Zorg ervoor dat in het vervolgkeuzemenu naast Afbeelding de CT-scan is geselecteerd, hier aangegeven met het cijfer nul. Klik op Toepassen en herhaal de procedure voor het cervicale thoracale gebied van belang en het thoracale skelet. Nadat u Otsu-drempels hebt gebruikt om de skeletgebieden van belang te maken, keert u terug naar het menu Navigatie en verwijdert u het interessegebied, of vinkt u de H-kolom aan voor zowel de ruwe lumbale als de cervicale thoracale gebieden van belang om ze te verbergen.
Vink de I-kolom aan voor beide skeletgebieden die van belang zijn, zodat ze niet kunnen worden bewerkt. Ga ten slotte terug naar de bovenkant van de 3D-operator voor interessegebieden en ga naar het menu 3D Paint om de betreffende dwarsmerggebieden te tekenen. Selecteer het gereedschap Bol opnieuw en traceer het ruggenmerg in het skelet voor zowel de lumbale als de thoracale romp, waarbij u ervoor zorgt dat het juiste interessegebied onder aan het menu wordt geselecteerd.
Om een interessegebied te wissen, klikt u op Command/Control en tekent u over het te wissen gedeelte. Controleer het interessegebied van het ruggenmerg vanuit alle drie de vlakken om er zeker van te zijn dat er geen interessegebied buiten de wervelkolom wordt getekend. Als het PET-signaal is uitgeschakeld, drukt u op F3 nadat de betreffende dwarslaesie is getekend om de PET weer in te schakelen, of selecteert u de Visual Controller en klikt u op de PET-balk.
Ga terug naar het menu Navigatie. Klik op het rasterpictogram om de tabel weer te geven. Kopieer de tabel naar spreadsheetsoftware en sla het bestand op.
PET-beeldvorming toonde verhoogde radiotracerbinding in de hersenen en het thoracale ruggenmerg van EAE-muizen in vergelijking met de naïeve muizen. Ex vivo gammatelling toonde een verhoogde binding in zowel lumbale als cervicale thoracale spinale segmenten en de hersenen van EAE-muizen in vergelijking met naïeve muizen. Ex vivo autoradiografiebeelden toonden een verhoogde radiotracerbinding in sagittale hersensecties, met name in de hersenstam, het cerebellum en de ventrikels van EAE-muizen in vergelijking met naïeve muizen.
Evenzo werd een verhoogde radiotracerbinding waargenomen in zowel de cervicale, thoracale als lumbale ruggenmergsegmenten van EAE-muizen in vergelijking met naïeve ruggenmerg. Na PET-beeldvorming en gammatelling kunnen we de relatie tussen PET-signaal en het doelwit van belang onderzoeken door middel van moleculair-biologische technieken, zoals flowcytometrie en immunohistochemie. Onze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers om vragen te stellen over de in vivo rol van B-cellen in meerdere ziektegebieden, waaronder beroerte, multiple sclerose, andere auto-immuunziekten en kanker.
