Denne teknikken bruker PET-avbildning for å belyse in vivo-fordelingen og dynamikken til B-celler i sentralnervesystemet. Vår tilnærming er gunstig for å studere nevrologiske sykdommer, hvor den berørte ryggmargen gjør analysen mer utfordrende. Så det er et par hovedfordeler med teknikken vår.
Først har vi laget et nytt verktøy for å spore en pan B-cellebiomarkør som lar oss fange en rekke B-celleundergrupper og visualisere dem in vivo. For det andre muliggjør vår ryggmargsanalysemetode svært nøyaktig og reproduserbar kvantifisering av PET-signaler i denne regionen. Det fine med teknikken vår er at den er sykdomsagnostisk.
Den kan brukes fra preklinisk til klinisk PET-avbildning i ethvert scenario, hvor B-celler og / eller ryggmargen er av interesse. 18 til 24 timer etter radiomerking og injeksjon av antistoffet i musen, klargjør musen for skanning ved å påføre øyegel på øynene. Forsikre deg om at skannesengen med fire mus er utstyrt med en varmepute med isofluran sett fra 1,5 til 2 %Plasser musen i liggende stilling på skannesengen, og trekk forsiktig i musehalen for å rette ryggraden.
Når musen er i liggende stilling, teip den sikkert med myk mikroskoptape over hodet og magen for å minimere bevegelsen fra å puste. Lag en oversikt over skanneposisjonen for hver mus i en laboratorienotatblokk. Etter å ha sikret den første gruppen, lukk sengen og sjekk sengeplasseringen ved å kjøre en CT-skanning.
Klikk på CT Center Field of View, og når sengen er på plass, kjør CT-testskanningen for å sikre at plasseringen er riktig. Gjenta til sengestillingen er tilfredsstillende. Plasser en liten hvit tape på skanneren for å markere riktig sengeplassering for resten av studien.
Åpne Motion Controller-menyen, og klikk på PET Center Field of View for å flytte musene inn i PET-ringen. Når sengen er i PET-ringen, starter du skannesekvensen ved å klikke på Kjør, og venter på at skanneren automatisk fullfører PET-skanningen, og flytter fra PET-ringen til CT for CT-oppkjøp. Siden eksperimentell autoimmun encefalomyelitt, eller EAE, har mus uttalt krumning i ryggraden på grunn av sykdomsprogresjon, og skanner dem mens de er på ryggen, bidrar til å rette ryggraden.
Lag et snitt nedover ryggsiden av dyret, og fjern huden og pelsen for å eksponere ryggraden. Skjær langs tre tverrplan gjennom ryggraden i nakken, rett under ribbeholderen, og på toppen av bekkenet for å skille lumbale fra livmorhals- og thoraxområdene. Fjern forsiktig den segmenterte ryggraden for å få to stykker, lumbal og cervikal thorax.
Isoler deretter lumbale ryggraden ved forsiktig å trimme ryggraden fra bekkenenden til lumbale ryggmargen er synlig. For å utvise lumbale ryggmargen, bruk en glidespisssprøyte fylt med PBS og opprett en forsegling mellom sprøyten og ryggraden ved hjelp av tommelen og pekefingeren. Trykk forsiktig PBS gjennom sprøyten for å drive ryggmargen ut på en absorberende pute, og gjenta for cervikal thorax ryggmarg ved å sette sprøyten fra livmorhalssiden.
Plasser ryggmargen vev i en gamma telle rør. Registrer tørrvekten, og tilsett PBS for å sikre at vevet er på bunnen av røret for å unngå tørking. Legg røret på is til det er klart for telling.
Hvis du vil starte analysen av områder av interesse i ryggmargen, åpner du verktøyet for 3D-interesseområde fra navigasjonsmenyen. Under overskriften Interesseområder bruker du plusstegnet nederst på menyen for å opprette seks interesseområder, lumbalområde av interesse, cervikal thorax interesseområde, lumbalskjelett, thoraxskjelett, lumbal ryggmarg, thoracic ryggmarg. For å unngå visuell forstyrrelse fra PET-signalet, klikk på F3 for å slå av PET.
Gå til toppen av 3D-området til Verktøyoperatør for 3D-område, og klikk på den heltrukne prikken til høyre for markørsymbolet for å åpne menyen 3D-malingsmodus og Eroder/Eliter. Velg Sphere, og endre størrelsen til 20 piksler. Likeledes sett utvide til pluss fem.
Før du går videre, gå til bunnen av menyen, og sørg for at lumbalområdet av interesse er valgt. På CT finner du L6-ryggvirvelen i ryggraden. Start med en ryggvirvel over L6, tegn et grovt lumbalområde av interesse over de fem ryggvirvlene over hoftene.
Bytt deretter til cervikal thoracic region av interesse, og spore resten av ryggraden til bunnen av skallen. Når du har tegnet de generelle interesseområdene, går du til toppen av operatoren og velger menyen Segmenteringsalgoritmer. Fra rullegardinmenyen velger du Otsu Thresholding, velg deretter lumbal region av interesse for inngangen, og sørg for at lumbalskjelett er valgt nederst på menyen.
I rullegardinmenyen ved siden av Bilde, sørg for at CT-skanningen er valgt, indikert her med tallet null. Klikk på Bruk, og gjenta prosedyren for cervical thorax region av interesse og thoracic skjelett. Etter å ha brukt Otsu Thresholding til å opprette skjelettområdene av interesse, gå tilbake til navigasjonsmenyen og slett interesseområdet, eller merk av i H-kolonnen for både de grove lumbale og cervikale thoraxområdene av interesse for å skjule dem.
Merk av i kolonnen I for begge skjelettområdene av interesse, slik at de ikke kan redigeres. Til slutt går du tilbake til toppen av verktøyet Verktøyoperatør for 3D-område og går til 3D Paint-menyen for å tegne ryggmargsområdene av interesse. Velg Sphere-verktøyet igjen, og spor ryggmargen i skjelettet for både lumbal og thorax, slik at riktig interesseområde er valgt nederst i menyen.
For å slette en region av interesse, klikk på Kommando / Kontroll og tegn over delen som skal slettes. Sjekk ryggmargsområdet av interesse fra alle tre planene for å sikre at ingen region av interesse er trukket utenfor ryggraden. Hvis PET-signalet ble slått av, trykker du på F3 etter at ryggmargsområdene av interesse er tegnet for å slå på PET igjen, eller velg den visuelle kontrolleren og klikk på PET-linjen.
Gå tilbake til navigasjonsmenyen. Klikk på rutenettikonet for å vise tabellen. Kopier tabellen til regnearkprogramvare, og lagre filen.
PET-avbildning viste forhøyet radiotracerbinding i hjernen og thoracal ryggmarg hos EAE-mus sammenlignet med de naive musene. Ex vivo gamma-telling viste økt binding i både lumbale og cervicale thoracale spinalsegmenter, og hjernen til EAE-mus sammenlignet med naive. Ex vivo autoradiografibilder viste økt radiotracerbinding i sagittale hjerneseksjoner, spesielt i hjernestammen, lillehjernen og ventriklene til EAE-mus sammenlignet med naive mus.
På samme måte ble det observert en økt radiotracerbinding i både cervikale thorax og lumbale ryggmargssegmenter av EAE-mus sammenlignet med naive ryggmarger. Etter PET-avbildning og gammatelling kan vi undersøke sammenhengen mellom PET-signal og målet av interesse gjennom molekylærbiologiske teknikker, som flowcytometri og immunhistokjemi. Vår teknikk har banet vei for forskere å stille spørsmål om in vivo-rollen til B-celler i flere sykdomsområder, inkludert hjerneslag, multippel sklerose, andre autoimmune sykdommer og kreft.
