Denna teknik använder PET-avbildning för att belysa in vivo-fördelningen och dynamiken hos B-celler i centrala nervsystemet. Vårt tillvägagångssätt är fördelaktigt för att studera neurologiska sjukdomar, där den drabbade ryggmärgen gör analysen mer utmanande. Så det finns ett par huvudsakliga fördelar med vår teknik.
För det första har vi skapat ett nytt verktyg för att spåra en pan B-cellsbiomarkör som gör det möjligt för oss att fånga en rad B-cellsundergrupper och visualisera dem in vivo. För det andra möjliggör vår ryggmärgsanalysmetod mycket noggrann och reproducerbar kvantifiering av PET-signaler i denna region. Det fina med vår teknik är att den är sjukdomsagnostisk.
Den kan användas från preklinisk till klinisk PET-avbildning i alla scenarier, där B-celler och/eller ryggmärgen är av intresse. 18 till 24 timmar efter radiomärkning och injektion av antikroppen i musen förbereds musen för skanning genom att applicera ögongel på ögonen. Se till att skanningsbädden med fyra möss är utrustad med en värmedyna med isofluran inställd från 1,5 till 2 %Placera musen i ryggläge på skanningsbädden och dra försiktigt i mussvansen för att räta ut ryggraden.
När musen är i ryggläge, tejpa den säkert med mjuk mikroskoptejp över huvudet och magen för att minimera rörelsen från andningen. Anteckna genomsökningspositionen för varje mus i en labbanteckningsbok. När du har säkrat den första gruppen, stäng sängen och kontrollera sängplaceringen genom att köra en datortomografi.
Klicka på CT Center Field of View, och när sängen är på plats, kör CT-testskanningen för att säkerställa att placeringen är korrekt. Upprepa tills sängpositionen är tillfredsställande. Placera en liten vit tejp på skannerbädden för att markera rätt sängplacering för resten av studien.
Öppna menyn Motion Controller och klicka på PET Center Field of View för att flytta mössen till PET-ringen. När sängen är i PET-ringen, starta skanningssekvensen genom att klicka på Kör och vänta tills skannern automatiskt slutför PET-skanningen och flytta från PET-ringen till CT för CT-insamling. Eftersom experimentell autoimmun encefalomyelit, eller EAE, möss har uttalad krökning av ryggraden på grund av sjukdomsprogression, hjälper skanning av dem på rygg till att räta ut ryggraden.
Gör ett snitt längs djurets ryggsida och ta bort skinn och päls för att exponera ryggraden. Skär längs tre tvärplan genom ryggraden vid halsen, direkt under bröstkorgen och högst upp i bäckenet för att skilja ländryggen från hals- och bröstregionerna. Ta försiktigt bort den segmenterade ryggraden för att få två delar, ländryggen och halsryggen.
Isolera sedan ländryggspelaren genom att försiktigt trimma ryggraden från bäckenänden tills ländryggsmärgen är synlig. För att driva ut ländryggmärgen, använd en spruta fylld med PBS och skapa en tätning mellan sprutan och ryggraden med tummen och pekfingret. Tryck försiktigt PBS genom sprutan för att driva ut ryggmärgen på en absorberande dyna och upprepa för cervikal bröstryggmärg genom att föra in sprutan från den cervikala sidan.
Placera ryggmärgsvävnaderna i ett gammaräknerör. Registrera torrvikten och tillsätt PBS för att säkerställa att vävnaden är i botten av röret för att undvika uttorkning. Lägg röret på is tills det är klart för räkning.
För att påbörja analysen av intresseområden i ryggmärgen, öppna 3D-verktyget för intresseområden från navigeringsmenyn. Under rubriken Intresseområden använder du plustecknet längst ned på menyn för att skapa sex intresseområden, ländryggsområde, cervikalt bröstkorgsområde av intresse, ländryggsskelett, bröstskelett, ländryggmärg, bröstryggmärg, bröstryggmärg. För att undvika visuell störning från PET-signalen, klicka på F3 för att stänga av PET.
Gå till toppen av verktygsoperatorn för 3D-intresseområde och klicka på den heldragna punkten till höger om markörsymbolen för att öppna menyn 3D-målningsläge och menyn Erodera/Vidga. Välj Sfär och ändra storleken till 20 bildpunkter. På samma sätt ställer du in dilate till plus fem.
Innan du går vidare, gå till botten av menyn och se till att ländryggen är markerad. På CT hittar du L6-kotan i ryggraden. Börja med en kota ovanför L6 och rita ett grovt ländryggsområde av intresse över de fem kotorna ovanför höfterna.
Byt sedan till cervikal bröstkorg av intresse och spåra resten av ryggraden till skallbasen. När du har ritat de generaliserade områdena av intresse går du till toppen av operatorn och väljer menyn Segmenteringsalgoritmer. Från rullgardinsmenyn väljer du Otsu Thresholding, väljer sedan ländryggsregion av intresse för ingången och ser till att ländryggsskelett väljs längst ner på menyn.
I rullgardinsmenyn bredvid Bild, se till att CT-skanningen är vald, här indikerad med siffran noll. Klicka på Verkställ och upprepa proceduren för cervikal bröstkorg av intresse och bröstskelett. När du har använt Otsu Thresholding för att skapa skelettregioner av intresse, gå tillbaka till navigeringsmenyn och ta bort intresseområdet, eller markera H-kolumnen för både de grova ländryggs- och cervikala bröstkorgsregionerna av intresse för att dölja dem.
Markera I-kolumnen för båda skelettområdena av intresse, så att de inte kan redigeras. Slutligen, gå tillbaka till toppen av 3D Region of Interest Tool Operator och gå till 3D Paint-menyn för att rita de ryggmärgsområden som är av intresse. Välj sfärverktyget igen och spåra ryggmärgen i skelettet för både ländryggen och bröstkorgen, och se till att rätt intresseområde väljs längst ner på menyn.
För att radera ett område av intresse, klicka på Kommando/Ctrl och rita över den del som ska raderas. Kontrollera ryggmärgsområdet av intresse från alla tre planen för att säkerställa att inget intresseområde dras utanför ryggraden. Om PET-signalen stängdes av, tryck på F3 efter att ryggmärgsområdena av intresse har ritats för att slå på PET igen, eller välj den visuella styrenheten och klicka på PET-fältet.
Gå tillbaka till navigeringsmenyn. Klicka på rutnätsikonen för att visa tabellen. Kopiera tabellen till kalkylprogram och spara filen.
PET-avbildning visade förhöjd bindning av radioaktivt spårämne i hjärnan och bröstryggmärgen hos EAE-möss jämfört med de naiva mössen. Ex vivo gammaräkning visade ökad bindning i både ländryggen och halsryggen och hjärnan hos EAE-möss jämfört med naiva. Ex vivo autoradiografibilder visade ökad bindning av radioaktivt spårämne i sagittala hjärnsnitt, särskilt i hjärnstammen, lillhjärnan och ventriklarna hos EAE-möss jämfört med naiva möss.
På liknande sätt observerades en ökad bindning av radioaktivt spårämne i både hals- och ländryggssegmenten hos EAE-möss jämfört med naiva ryggmärgsryggar. Efter PET-avbildning och gammaräkning kan vi undersöka förhållandet mellan PET-signalen och det intressanta objektet genom molekylärbiologiska tekniker, såsom flödescytometri och immunhistokemi. Vår teknik har banat väg för forskare att ställa frågor om B-cellernas roll in vivo inom flera sjukdomsområden, inklusive stroke, multipel skleros, andra autoimmuna sjukdomar och cancer.
