Name: histology basics and cell death detection in honeybee tissue
Uploaded: 2022-07-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Histology Basics and Cell Death Detection in Honeybee Tissue at JoVE.com

אני מודה על תמיכת סוכנות המחקר הסלובנית, מענק מס 'P4-133.

1. היסטולוגיה בסיסית לחקר דבורת הדבש
<ol><li>דיסקציה של רקמת דבורת הדבש הערה: לנתיחה של דבורים עובדות, השתמש במיקרוסקופ מנתח עם מקור אור LED. ההגדלה השימושית ביותר היא ~ 20x.<ol><li>מניפולציה ונתיחה<ol><li>בזהירות לקחת דבורה עובד עם מלקחיים ולשים אותו על קרח (או לתוך המקפיא ב -20 מעלות צלזיוס) ב...

<ol>
	<li>Ruttner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Naturgeschichte der Honigbienen. , (1992).</li><li>Jordan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kleine+Bienenkunde.">Kleine Bienenkunde.</a> &#214;sterreichischer Agrarverlag Wien M&#252;nchen. , 41-45 (1964).</li><li>Snodgrass, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Anatomy+of+the+Honey+Bee.">The Anatomy of the Honey Bee.</a> The Hive and the Honey Bee. , 111-113 (1975).</li><li>Snodgrass, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Anatomy of the Honey Bee. , (2004).</li><li>Hrassnigg, N., Crailsheim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+hypopharyngeal+gland+development+to+the+brood+status+of+honeybee+(Apis+mellifera+L.)+colonies.">Adaptation of hypopharyngeal gland development to the brood status of honeybee (Apis mellifera L.) colonies.</a> Journal of Insect Physiology. 44 (10), 929-939 (1998).</li><li>Smodi&#353; &#352;kerl, M. I., Gregorc, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+hypopharyngeal+glands+in+honeybees+(Apis+mellifera+carnica)+from+a+nurse+colony.">Characteristics of hypopharyngeal glands in honeybees (Apis mellifera carnica) from a nurse colony.</a> Slovenian Veterinary Research. 52 (2), 67-74 (2015).</li><li>Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Change+in+the+expression+of+hypopharyngeal-gland+proteins+of+the+worker+honeybees+(Apis+mellifera+L.)+with+age+and/or+role.">Change in the expression of hypopharyngeal-gland proteins of the worker honeybees (Apis mellifera L.) with age and/or role.</a> Journal of Biochemistry. 119 (2), 291-295 (1996).</li><li>Sammataro, D., Yoder, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Honey bee colony health: Challenges and sustainable solutions. , 302 (2012).</li><li>Crailsheim, K., Stolberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+diet,+age+and+colony+condition+upon+intestinal+proteolytic+activity+and+size+of+the+hypopharyngeal+glands+in+the+honeybee+(Apis+mellifera+L.).">Influence of diet, age and colony condition upon intestinal proteolytic activity and size of the hypopharyngeal glands in the honeybee (Apis mellifera L.).</a> Journal of Insect Physiology. 35 (8), 595-602 (1998).</li><li>Smodi&#353; &#352;kerl, M. I., Gregorc, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+proteins+and+cell+death+in+situ+localisation+in+hypopharyngeal+glands+of+honeybee+(Apis+mellifera+carnica)+workers+after+imidacloprid+or+coumaphos+treatment.">Heat shock proteins and cell death in situ localisation in hypopharyngeal glands of honeybee (Apis mellifera carnica) workers after imidacloprid or coumaphos treatment.</a> Apidologie. 41 (1), 73-86 (2010).</li><li>Gregorc, A., Bowen, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histochemical+characterisation+of+cell+death+in+honeybee+larvae+midgut+after+treatment+with+Paenibacillus+larvae,+Amitraz+and+Oxytetracycline.">The histochemical characterisation of cell death in honeybee larvae midgut after treatment with Paenibacillus larvae, Amitraz and Oxytetracycline.</a> Cell Biology International. 24 (5), 319-324 (2000).</li><li>Higes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+in+the+pathogenesis+of+Nosema+ceranae+(Microsporidia:+Nosematidae)+in+honey+bees+(Apis+mellifera).">Apoptosis in the pathogenesis of Nosema ceranae (Microsporidia: Nosematidae) in honey bees (Apis mellifera).</a> Environmental Microbiology Reports. 5 (4), 530-536 (2013).</li><li>Kurze, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+dynamics+of+Nosema+ceranae+in+honey+bee+midgut+and+host+cell+apoptosis.">Infection dynamics of Nosema ceranae in honey bee midgut and host cell apoptosis.</a> Journal of Invertebrate Pathology. 154, 1-4 (2018).</li><li>Johnson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Honey+bee+toxicology.">Honey bee toxicology.</a> Annual Review of Entomology. 60 (1), 415-434 (2005).</li><li>Gashout, H. A., Guzman-Novoa, E., Goodwin, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+and+natural+acaricides+impair+hygienic+and+foraging+behaviors+of+honey+bees.">Synthetic and natural acaricides impair hygienic and foraging behaviors of honey bees.</a> Apidologie. 51 (6), 1155-1165 (2020).</li><li>McMenamin, A. J., Genersch, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Honey+bee+colony+losses+and+associated+viruses.">Honey bee colony losses and associated viruses.</a> Current Opinion in Insect Science. 8, 121-129 (2015).</li><li>Ramsey, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Varroa+destructor+feeds+primarily+on+honey+bee+fat+body+tissue+and+not+hemolymph.">Varroa destructor feeds primarily on honey bee fat body tissue and not hemolymph.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 116 (5), 1792-1801 (2019).</li><li>Requier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Honey+bee+diet+in+intensive+farmland+habitats+reveals+an+unexpectedly+high+flower+richness+and+a+major+role+of+weeds.">Honey bee diet in intensive farmland habitats reveals an unexpectedly high flower richness and a major role of weeds.</a> Ecological Applications. 25 (4), 881-890 (2015).</li><li>Santos, C., Serr&#227;o, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histology+of+the+ileum+in+bees+(Hymenoptera,+Apoidea).">Histology of the ileum in bees (Hymenoptera, Apoidea).</a> Brazilian Journal of Morphological Sciences. 23 (3), 405-413 (2006).</li><li>Suwannapong, G., Saichon, C., Benbow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histochemical+comparison+of+the+hypopharyngeal+gland+in+Apis+cerana+Fabricius,+1793+workers+and+Apis+mellifera+Linnaeus,+1758+workers.">Histochemical comparison of the hypopharyngeal gland in Apis cerana Fabricius, 1793 workers and Apis mellifera Linnaeus, 1758 workers.</a> Psyche: A Journal of Entomology. , (2010).</li><li>Ceylan, A., Sevin, S., &#214;zgen&#231;, &. #. 2. 1. 4. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histomorphological+and+histochemical+structure+of+the+midgut+and+hindgut+of+the+Caucasian+honey+bee+(Apis+mellifera+caucasia).">Histomorphological and histochemical structure of the midgut and hindgut of the Caucasian honey bee (Apis mellifera caucasia).</a> Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences. 43 (6), 747-753 (2019).</li><li>Human, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miscellaneous+standard+methods+for+Apis+mellifera+research.">Miscellaneous standard methods for Apis mellifera research.</a> Journal of Apicultural Research. 52 (4), 1-53 (2013).</li><li>Gregorc, A., Smodi&#353; &#352;kerl, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+and+immunohistochemical+testing+of+honeybees+after+oxalic+and+rotenone+treatments.">Toxicological and immunohistochemical testing of honeybees after oxalic and rotenone treatments.</a> Apidologie. 38 (3), 296-305 (2007).</li><li>Carreck, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+methods+for+Apis+mellifera+anatomy+and+dissection.">Standard methods for Apis mellifera anatomy and dissection.</a> Journal of Apicultural Research. 52 (4), 1-40 (2013).</li><li>Bowen, I. D., Bowen, S. M., Jones, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mitosis and apoptosis: Matters of Life and Death. , (1998).</li><li>Eisenberg-Lerner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+and+death+partners:+apoptosis,+autophagy+and+the+cross-talk+between+them.">Life and death partners: apoptosis, autophagy and the cross-talk between them.</a> Cell Death and Differentiation. 16 (7), 966-975 (2009).</li><li>Bowen, I. D., Mullarkey, K., Morgan, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+in+the+salivary+gland+of+the+blow+fly+Calliphora+vomitoria.">Programmed cell death in the salivary gland of the blow fly Calliphora vomitoria.</a> Microscopy Research Techniques. 34, 202-207 (1996).</li><li>D'Arcy, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death:+a+review+of+the+major+forms+of+apoptosis,+necrosis+and+autophagy.">Cell death: a review of the major forms of apoptosis, necrosis and autophagy.</a> Cell Biology International. 43 (6), 582-592 (2019).</li><li>Matylevitch, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+and+accidental+cell+death+in+cultured+human+keratinocytes+after+thermal+injury.">Apoptosis and accidental cell death in cultured human keratinocytes after thermal injury.</a> American Journal of Pathology. 153 (2), 567-577 (1998).</li><li>Perry, S. W., Epstein, L. G., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+in+situ+detection+of+apoptosis+and+necrosis+in+monolayer+cultures+by+TUNEL+and+trypan+blue+staining.">Simultaneous in situ detection of apoptosis and necrosis in monolayer cultures by TUNEL and trypan blue staining.</a> BioTechniques. 22 (6), 1102-1106 (1997).</li><li>Cuello-Carrion, F. D., Ciocca, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+detection+of+apoptotic+cells+using+a+modified+in+situ+TUNEL+technique.">Improved detection of apoptotic cells using a modified in situ TUNEL technique.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 47 (6), 837-839 (1999).</li><li>Gregorc, A., Bowen, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+in+the+honeybee+(Apis+mellifera+L.)+larvae+midgut.">Programmed cell death in the honeybee (Apis mellifera L.) larvae midgut.</a> Cell Biology International. 21 (3), 151-158 (1997).</li><li>Gregorc, A., Poga&#269;nik, A., Bowen, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+in+honey+bee+(Apis+mellifera)+larvae+treated+with+oxalic+or+formic+acid.">Cell death in honey bee (Apis mellifera) larvae treated with oxalic or formic acid.</a> Apidologie. 35 (5), 453-460 (2004).</li></ol>

באורגניזמים חיים, מוות תאי מוגדר כאפופטוזיס או נמק25 ויכול להיות מלווה באוטופגיה26. ההבדל בין תאים אפופטוטיים לנמקיים הוא שאפופטוזיס הוא סוג של מוות תאי מתוכנת ומופיע בתאים רגילים, בעוד נמק מתרחש עקב תנאים קטלניים (למשל, תאונה, מחלה)27,28<...

דבורי הדבש (Apis mellifera L.) הן, בין שאר מאביקות הבר, המאביקות החשובות ביותר של צמחים חקלאיים. במשך אלפי שנים, הסביבה המשתנה השפיעה על הדבורים להתאים את המורפולוגיה, הפיזיולוגיה, ההתנהגות והעמידות שלהן למספר פתוגנים וטפילים. לכן, דבורי הדבש פיתחו מגוון רחב מאוד של מינים ותת-מינים ברחבי העולם1. תוצאות אלה עולות בקנה אחד עם ממצאים קודמים, שלפיהם קיימת שונות גנטית במבנה מערכת העיכול של דבורת הדבש, אך גם מצביעות על כך ששינויים במידגוט נובעים מגורמים סביבתיים 2,3.
מערכת העיכול של דבורת הדבש כוללת שלושה חלקים עיקריים: פורגוט, מידגוט (ventriculus) והינדגוט4. החדר הוא איבר חיוני לעיכול אבקה וצוף/דבש; ב hindgut, שליטה אוסמוטית מתרחשת באמצעות ספיגת מים ויונים2. בלוטות ההיפו-לוע (HPGs) של עובדי דבורת הדבש ממוקמות בראש ומסנתזות ומפרישות רכיבי מזון מלכות כדי להאכיל את הברוד, את המלכה ואת חברי המושבה. גודלם משתנה עם הגיל והמשימות ותלוי בתזונה נכונה (אבקה איכותית). עובדי אחיות בגילאי 6 עד 18 ימים מבצעים גידול גזעים, וגודל ה- HPGs גדלב- 5,6. בדבורים, ה-HPGs מתנוונים ומפרישים רק אנזימים החשובים להמרת הסוכרים המורכבים לפשוטים (α-גלוקוזידאזות, לאוצין ארילאמידאז, אינברטאז) בדבש7.
דבורי הדבש נחשפות למספר גורמי עקה ביוטיים וא-ביוטיים8, ומערכת העיכול עלולה להיות מושפעת ממספר ממריצים שליליים. המחסום הראשון המגן על האורגניזם מפני פתוגנים הוא הממברנה הפריטרופית ב midgut, אשר מורכב רירית המעי כדי להגן מפני פתוגנים4. ההתפתחות והתפקוד של HPGs תלויים בתזונה, בגיל ובמצב המושבה9, והם מושפעים מקוטלי חרקים, אקריצידים 10 ופתוגנים11,12,13. שאריות של קוטל בקראיים בכוורת עקב טיפול בהדברת וורואה וחומרי הדברה מהסביבה משפיעים על דבורי מספוא ודבורים אחיות14,15. האיום הגדול ביותר על מושבות דבורי הדבש הוא משמיד הקרדית Varroa, הן כווקטור של וירוסים התורמים לאובדן מושבות16 והן כצרכן של גוף השומן של המארח (איבר חיוני חשוב בדבורי הדבש), וכתוצאה מכך משפיע על גופו של הפרט ועל תפקודי המושבה17.
עם זאת, בתי גידול חקלאיים אינטנסיביים יכולים לספק אספקת מזון לטווח קצר לדבורי הדבש. לכן, תוכניות חקלאיות-סביבתיות צריכות לשפר את הזמינות של פרחי דבש בנופים חקלאיים18. כדי להעריך את המורפולוגיה של תת-מינים שונים 6,19,20,21 או השפעות תת-קטלניות של גורמים אלה ברמת התא או הרקמה, במיוחד midgut ו- HPGs, שיטות היסטולוגיות ואימונוהיסטוכימיות הן מעשיות ומדויקות מספיק כדי לשמש במחקר היסטולוגיה בדבורי דבש.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApopTag Peroxidase kit (ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7100</td>
			<td>Assay B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA 
			jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE 
			j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx 
			H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA 
			vD_BwE; Positive controls included in S7101</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeadEnd Colorimetric TUNEL system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7360</td>
			<td>Assay A, https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope&#160; (for bee dissection)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding cassette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision System alkaline phosphatase kit</td>
			<td>Dako</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>alcoholic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>95% (or less pure), 90%, 80%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faramount mounting medium, aqueous</td>
			<td>Dako</td>
			<td></td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flattening table</td>
			<td>Leica</td>
			<td>HI1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps&#160; (for bee dissection)</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11294-00</td>
			<td>Standard #4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin 10%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Formaldehyde</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoChoice Clearing Agent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>clearing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxidase 3%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect pins&#160; (for bee dissection)</td>
			<td>Entosphinx</td>
			<td>44594</td>
			<td>Insect pins stainless steel &#8211; white, size 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISCDDK, AP (In Situ Cell Death Detecteion Kit, Alkaline Phosphatase)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11684809910</td>
			<td>Assay C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b 
			ul.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab clock</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Box with the slides must be preserved in a plastic wrap to prevent dust</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modular tissue embedding station</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 4%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.5 mL; 3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish&#160; (for bee dissection)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Filled with condensation silicon&#160; (Xantoprene L blue and Universal liquid plus activator)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Merck</td>
			<td>21627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringers&#39; solution&#160; (for bee dissection)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>7.5 g NaCL, 2.38 g Na2HPO4, 2.72 g KH2PO4, 1 L distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors&#160; (for bee dissection)</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>1406-09, 14061-09</td>
			<td>Straight and curved, 9 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal liquid plus activator&#160; (for bee dissection)</td>
			<td>Kulzer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Watchmaker&#8217;s forceps (for bee dissection)</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>91100-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Watercolor brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xantoprene L blue&#160; (for bee dissection)</td>
			<td>Kulzer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

histology basics and cell death detection in honeybee tissue

דבורי הדבש (Apis mellifera L.) בתוך הכוורת (אחיות ודבורי כוורת אחרות) ומחוץ לכוורת (foragers) חשופות לשינויי אקלים ומזג אוויר, חומרי הדברה שונים, פתוגנים ותת תזונה, הנכנסים בעיקר דרך הפה ומשפיעים בעיקר על דרכי העיכול של דבורים בוגרות. כדי להבין ולמנוע את ההשפעות של גורמי לחץ חיצוניים ופנימיים כאלה על דבורי הדבש, אחת משיטות המחקר השימושיות היא השיטה האימונוהיסטוכימית. פרוטוקול בסיסי מתואר להכנת בלוטות האמצע (ventriculus) וההיפו-לוע (HPGs) של דבורים בוגרות לניתוח היסטולוגי. מתודולוגיה מפורטת מתוארת כדי להעריך את רמת הנזק לתאים ולהבחין בין נמק למוות תאי מתוכנת (אפופטוזיס) כתהליך טבעי של התחדשות רקמות. תוצאות הטיפול בדבורת הדבש הבוגרת בחומצה אוקסלית ובחומרי הדברה (קוטל חרקים ואקריציד) וקביעת מוות תאי בחדר וב- HPGs מוצגות. היתרונות והחסרונות של המתודולוגיה נדונים גם הם.

זיהוי מוות תאי במרכז הגוף דבורים עובדות חדשות (Apis mellifera carnica) מהמכוורת הניסיונית במכון החקלאי של סלובניה בלובליאנה טופלו בנפרד ב-3% חומצה אוקסלית (OA)23. OA משמש לעתים קרובות בגידול דבורים לבקרת הרס Varroa . לאחר הטיפול, הדבורים העובדות (שלוש מכל קבוצה) היו משותקות ?...

Watch this Scientific Journal Video about Histology Basics and Cell Death Detection in Honeybee Tissue at JoVE.com

Histology Basics and Cell Death Detection in Honeybee Tissue

שיטות אימונוהיסטוכימיות שימושיות במחקר דבורת הדבש כדי לזהות ולהעריך את רמת האפופטוזיס והנמק בבלוטות האמצע והלוע של דבורים בוגרות.

יסודות ההיסטולוגיה וזיהוי מוות תאי ברקמת דבורת הדבש

Honeybees (Apis mellifera L.) inside the hive (nurse workers and other hive bees) and outside the hive (foragers) are exposed to climate and weather ...

פרוטוקול זה שימושי במחקרים ביולוגיים וטוקסיקולוגיים רבים של דבורי דבש שטופלו בחומרי הדברה. זה עוזר לזהות את התגובות הסלולריות של רקמת דבורת הדבש של acaricides המשמשים מושבות דבורים לטיפול נגד קרדית Varroa. זהו כלי רב עוצמה לזיהוי של השפעות תת-מעטות על רקמות בשילוב עם התנהגות של דבורים או חרקים מועילים אחרים.כדי להתחיל, בזהירות לקחת דבורה עובד עם מלקחיים ולשים אותו על קרח או מקפיא במינוס 20 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות כדי לשתק אותו. הצמידו את הדבורה לצלחת הפטרי באלכסון דרך החלק האחורי העליון של בית החזה פעמיים משמאל לימין ומימין לשמאל. חרק מסכן מלח כדי לכסות את הגוף.הניחו את צלחת הפטרי מתחת לסטריאומיקרוסקופ, התמקדו והתכווננו. כדי לנתח את המותניים, התחילו עם הבטן על ידי החדרת נקודה אחת של המספריים מתחת לטרגיט A5 במרכז הצד הימני של גוף הדבורה. חותכים לטרגיט A2. שמור על הלהב הפנימי של המספריים במקביל לצד הגוף כדי למנוע פגיעה באיברים הפנימיים.סובבו את המספריים שמאלה וחתכו. פתח בעדינות את החלק השמאלי של הבטן והצמיד אותו. בעזרת מלקחיים ביד אחת, מושכים בעדינות את בטן דבורת הדבש כלפי מעלה, וביד השנייה חותכים בקצה הוושט.מושכים את הבטן ואת המותניים הרחק מהבטן וחותכים בפי הטבעת. השתמש פיפטה עם תמיסת מלח חרקים ולהסיר כל צואה או חלקים של הרקמה. עבור כריתה של בלוטות hypopharyngeal, לשתק דבורה עובד על קרח כפי שתואר קודם.חתכו את הראש והניחו אותו על צלחת קטנה יותר כשהאנטנה פונה כלפי מעלה. אבטחו את הראש באמצעות שתי סיכות, האחת דרך העין המורכבת השמאלית והשנייה דרך העין המורכבת הימנית. בצע חתך על פני העין המורכבת הראשונה בצד הפנימי של הסיכות, המשך ללברום, ולאחר מכן בצע חתך נוסף בצד השני על פני העין המורכבת השנייה.נתק את האנטנות. מרימים את המסכה וחותכים היכן שעדיין מחוברים. קח את המלקחיים בזהירות להסיר את הבלוטות יחד עם המוח וחלק מהעיניים המורכבת.עבור hematoxylin ו eosin מכתים, לשים את החלקים dewaxed, מיובש מחדש בהמטוקסילין במשך חמש דקות. לאחר מכן, הניחו אותם בזהירות מתחת למי ברז זורמים למשך שתי דקות. לאחר מכן, לשים אותם לתוך מים מזוקקים במשך דקה אחת eosin במשך ארבע דקות.מניחים את השקופיות 96% אתנול למשך דקה אחת לאחר מכן 2-פרופנול למשך שתי דקות, ולבסוף לתוך סוכן הסליקה למשך שתי דקות. הוסיפו מדיום הרכבה וכוס כיסוי ותנו להם להתייבש. התבונן תחת מיקרוסקופ אור.מכינים צנצנות קופלין. מכינים פרוטאינאז-K. לאחר התייבשות וייבוש מחדש של החלקים, הניחו את השקופיות ב- PBS למשך חמש דקות.מניחים את השקופיות שטוחות במיכל ומוסיפים פרוטאינאז-K. שטפו את המגלשות במים מזוקקים. להרוות פרוקסידאז אנדוגני בטמפרטורת החדר.שטפו את המגלשות עם PBS או מים. הניחו את המגלשות שטוחות במיכל והפעילו את מאגר שיווי המשקל למשך 10 שניות בטמפרטורת החדר. לאחר ניגוב סביב הרקמה, הוסיפו את האנזים דאוקסינוקלאוטידיל טרנספראז לכל מקטע, ודגרו בתא לחות למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.לפני הדגירה, הניחו מגבות נייר לחות בתוך המגש סביב השקופיות וכסו אותן בניילון נצמד. לאחר הדגירה, הניחו את הדגימות על המדף והשאירו אותן במאגר לשטיפה. לאחר שטיפת השקופיות ב- PBS וניגוב סביב הרקמות, מוסיפים שתי טיפות של פרוקסידאז חם נגד דיגוקסיגנין מצומד למקטעים ודוגרים במשך 30 דקות במיכל לח.לאחר הכביסה ב-PBS, מכינים את מצע הפרוקסידאז, מכסים את החלקים במצע פרוקסידאז ומכתימים במשך חמש דקות. הניחו את השקופית מתחת למיקרוסקופ וקבעו את זמן הצביעה האופטימלי. לאחר שטיפת המגלשות במדף מכתים ומים מזוקקים, דגרו את המגלשות במים מזוקקים למשך חמש דקות.כתם נגדי באמצעות המטוקסילין למשך שתי דקות. שטפו את המגלשות על ידי הנחתן תחת מי ברז זורמים למשך שלוש דקות ולאחר מכן במים מזוקקים. הרכב את המגלשות מתחת לכיסויי זכוכית והרכבה בינונית והשאר שטוח לייבוש.התבונן תחת מיקרוסקופ אור. אחוז התאים הנגועים חושב באמצעות מיקרוסקופ אור. התוצאות הצביעו על כך שהטיפול בחומצה אוקסלית השפיע באופן משמעותי על התאים במידגוט.Immunostaining הראה תוצרי תגובה אדומים או חומים חיוביים בגרעינים האפופטוטיים של בלוטות הלוע. תוצר תגובה חיובית לאחר טיפול באימידקלופריד או קומפוס נקבע ברוב תאי הבלוטות. בעת הרמת המסכה של ראש הדבורה, היזהר לא לפגוע או למשוך את החלקים של בלוטות הלוע.טכניקה זו מזהה שינויים תת-קליניים בדבורים ומתאימה גם לזיהוי השפעות סביבתיות אחרות על דבורים ועל אורגניזמים חיים אחרים.

histology-basics-and-cell-death-detection-in-honeybee-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

אקטין Co-Assay שקיעה, כי ניתוח של חלבון מחייב את ה-F-אקטין

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Undecalcified Bone Preparation for Histology, Histomorphometry and Fluorochrome Analysis

Undecalcified bone histology demonstrates the micro-architecture of bone. It shows both the mineralised and cellular components of bone, which provides vital information on bone turnover or bone formation and resorption. This has tremendous importance in a variety of clinical and research applications. It yields beautiful images1 and allows for techniques such as fluorochrome assessment and histomorphometry2. Fluorochrome analysis is a technique where fluorescent dyes that bind to calcium are injected at a particular time point, which allows for quantification of the amount of mineralisation at that given time. Histomorphometry is a process of bone quantification at the microscopic level. 
Performing undecalcified bone histology is technically challenging, particularly with large size specimens. It requires variations in technique from those used in standard paraffin embedded histology. This video illustrates the process of producing good quality sections and demonstrates the technical difficulties and methods with which to overcome them. Specimen preparation, fixation and processing are achieved with a manner similar to other soft tissues, however due to the density and lower permeability of bone considerably longer fixation and processing times are required, often taking several weeks. Embedding is achieved using a supporting medium with similar or equal hardness and density to the bone such as methacrylate- based resins, but unlike paraffin infiltration and embedding, this is an irreversible step. Sectioning can be achieved by grinding which produces a thicker section, which is optimal for studies such as fluorochrome analysis. This is best achieved using a diamond blade on a macrotome. Alternatively, thinner sections can be produced for light microscopy and this is achieved using a sledge microtome with a very sharp blade. The sledge microtome provides the additional strength and stability required for large, hard blocks. Resin embedded sections can be stained with a variety of stains, which are demonstrated.

Undecalcified bone histology provides important information for a variety of clinical and research applications. It is technically challenging, particularly with large size specimens. This video illustrates the process of producing good quality sections and demonstrates the technical difficulties and methods with which to overcome them.

עצם הכנת Undecalcified עבור היסטולוגיה, Histomorphometry וניתוח Fluorochrome

Undecalcified bone histology demonstrates the micro-architecture of bone. It shows both the mineralised and cellular components of bone, which provides ...

A &#946;-glucuronidase (GUS) Based Cell Death Assay

We have developed a novel transient plant expression system that simultaneously expresses the reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), with putative positive or negative regulators of cell death. In this system, N. benthamiana leaves are co-infiltrated with a 35S driven expression cassette containing the gene to be analyzed, and the GUS vector pCAMBIA 2301 using Agrobacterium strain LBA4404 as a vehicle. Because live cells are required for GUS expression to occur, loss of GUS activity is expected when this marker gene is co-expressed with positive regulators of cell death. Equally, increased GUS activity is observed when anti-apoptotic genes are used compared to the vector control. As shown below, we have successfully used this system in our lab to analyze both pro- and anti-death players. These include the plant anti-apoptotic Bcl-2 Associated athanoGene (BAG) family, as well as, known mammalian inducers of cell death, such as BAX. Additionally, we have used this system to analyze the death function of specific truncations within proteins, which could provide clues on the possible post-translational modification/activation of these proteins. Here, we present a rapid and sensitive plant based method, as an initial step in investigating the death function of specific genes.

A &amp;#946;-glucuronidase GUS Based Cell Death Assay

Programmed cell death assays commonly used in mammalian systems such as DNA laddering or TUNEL assays, are often difficult to reproduce in plants. In combination with a GUS reporter system, we propose a rapid, plant based transient assay to analyze the potential death properties of specific genes.

Β-glucuronidase (גאס) נייד מבוסס מוות Assay

We have developed a novel transient plant expression system that simultaneously expresses the reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), with putative ...

Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and organs1,2,6,7. During development, toxic chemicals or genetic alterations can cause an increase in PCD or change PCD patterns resulting in developmental abnormalities and birth defects3-5. To understand the etiology of these defects, the study of embryos can be complemented with in vitro assays that use differentiating embryonic stem (ES) cells.
Apoptosis is a well-studied form of PCD that involves both intrinsic and extrinsic signaling to activate the caspase enzyme cascade. Characteristic cell changes include membrane blebbing, nuclear shrinking, and DNA fragmentation. Other forms of PCD do not involve caspase activation and may be the end-result of prolonged autophagy. Regardless of the PCD pathway, dying cells need to be removed. In adults, the immune cells perform this function, while in embryos, where the immune system has not yet developed, removal occurs by an alternative mechanism. This mechanism involves neighboring cells (called "non-professional phagocytes") taking on a phagocytic role-they recognize the 'eat me' signal on the surface of the dying cell and engulf it8-10. After engulfment, the debris is brought to the lysosome for degradation. Thus regardless of PCD mechanism, an increase in lysosomal activity can be correlated with increased cell death.
To study PCD, a simple assay to visualize lysosomes in thick tissues and multilayer differentiating cultures can be useful. LysoTracker dye is a highly soluble small molecule that is retained in acidic subcellular compartments such as the lysosome11-13. The dye is taken up by diffusion and through the circulation. Since penetration is not a hindrance, visualization of PCD in thick tissues and multi-layer cultures is possible12,13. In contrast, TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) analysis14, is limited to small samples, histological sections, and monolayer cultures because the procedure requires the entry/permeability of a terminal transferase.
In contrast to Aniline blue, which diffuses and is dissolved by solvents, LysoTracker Red DND-99 is fixable, bright, and stable. Staining can be visualized with standard fluorescent or confocal microscopy in whole-mount or section using aqueous or solvent-based mounting media12,13. Here we describe protocols using this dye to look at PCD in normal and sonic hedgehog null mouse embryos. In addition, we demonstrate analysis of PCD in differentiating ES cell cultures and present a simple quantification method. In summary, LysoTracker staining can be a great complement to other methods of detecting PCD.

We present a simple protocol to visualize regions of programmed cell death (PCD) in mouse embryos and differentiating embryonic stem (ES) cell cultures using a highly soluble dye called LysoTracker.

שימוש בLysoTracker לזהות מות תאים מתוכנים בעוברים ומיון תאי גזע עובריים

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

רנ&quot;א<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה בעוברי הר שלמים והיסטולוגיה הסלולרית מותאמת לElasmobranchs הימי

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called the auditory bulla houses the ossicles, whereas the auditory capsule encloses the inner ear, namely the cochlea and semicircular canals. Murine ossicles are essential for hearing and thus of great interest to researchers in the field of otolaryngology, but their metabolism, development, and evolution are highly relevant to other fields. Altered bone metabolism can affect hearing function in adult mice, and various gene-deficient mice show changes in morphogenesis of auditory ossicles in utero. Although murine auditory ossicles are tiny, their manipulation is feasible if one understands their anatomical orientation and 3D structure. Here, we describe how to dissect the auditory bulla and capsule of postnatal mice and then isolate individual ossicles by removing part of the bulla. We also discuss how to embed the bulla and capsule in different orientations to generate paraffin or frozen sections suitable for preparation of longitudinal, horizontal, or frontal sections of the malleus. Finally, we enumerate anatomical differences between mouse and human auditory ossicles. These methods would be useful in analyzing pathological, developmental and evolutionary aspects of auditory ossicles and the middle ear in mice.

We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.

דיסקציה של בולה השמיעה של עכברים אחרי לידה: בידוד של עצמות באוזן התיכונה ניתוח היסטולוגית

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...

Proteolytically Degraded Alginate Hydrogels and Hydrophobic Microbioreactors for Porcine Oocyte Encapsulation

In reproductive biology, the biotechnology revolution that began with artificial insemination and embryo transfer technology led to the development of assisted reproduction techniques such as oocyte in vitro maturation (IVM), in vitro fertilization (IVF) and cloning of domestic animals by nuclear transfer from somatic cell. IVM is the method particularly of significance. It is the platform technology for the supply of mature, good quality oocytes for applications such as reduction of the generation interval in commercially important or endangered species, research concerning in vitro human reproduction, and production of transgenic animals for cell therapies. The term oocyte quality includes its competence to complete maturation, be fertilized, thereby resulting in healthy offspring. This means that oocytes of good quality are paramount for successful fertilization including IVF procedures. This poses many difficulties to develop a reliable culture method that would support growth not only of human oocytes but also of other large mammalian species. The first step in IVM is the in vitro culture of oocytes. This work describes two protocols for the 3D culture of porcine oocytes. In the first, 3D model cumulus-oocyte complexes (COCs) are encapsulated in a fibrin-alginate bead interpenetrating network, in which a mixture of fibrin and alginate are gelled simultaneously. In the second one, COCs are suspended in a drop of medium and encapsulated with fluorinated ethylene propylene (FEP; a copolymer of hexafluoropropylene and tetrafluoroethylene) powder particles to form microbioreactors defined as Liquid Marbles (LM). Both 3D systems maintain the gaseous in vitro culture environment. They also maintain COCs 3D organization by preventing their flattening and consequent disruption of gap junctions, thereby preserving the functional relationship between the oocyte, and surrounding follicular cells.

Presented here are two protocols for the encapsulation of porcine oocytes in 3D culture conditions. In the first, cumulus-oocyte complexes (COCs) are encapsulated in fibrin-alginate beads. In the second, they are enclosed with fluorinated ethylene propylene powder particles (microbioreactors). Both systems ensure optimal conditions to maintain their 3D organization.

הידרוג'לים אלג'ינאט מפורקים ופרוטאוליטית ומיקרוביו-סיבה לאנקלוסציה של פורצין אוציט

In reproductive biology, the biotechnology revolution that began with artificial insemination and embryo transfer technology led to the development of ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related disorders continue to be a major contributor of deaths around the world, necessitating the need for even greater understanding of their pathobiology. Traditional antibody-based techniques like western blotting or immunohistochemistry suffer from being low-throughput besides being labor-intensive and qualitative or semi-quantitative. Even conventional mass spectrometry-based shotgun approaches fail to provide conclusive evidence to support a certain hypothesis. Targeted proteomics approaches are largely hypothesis driven and differ from the conventional shotgun proteomics approaches that have been long in use. Multiple reaction monitoring is one such targeted approach that requires the use of a special mass spectrometer called the tandem quadrupole mass spectrometer or triple quadrupole mass spectrometer. In the current study, we have systematically highlighted the major steps involved in performing a successful tandem quadrupole mass spectrometry-based proteomics workflow using human brain tissue with an aim to introduce this workflow to a broader research community.

The protocol aims to introduce the use of a triple quadrupole mass spectrometer for Multiple Reaction Monitoring (MRM) of proteins from clinical samples. We have provided a systematic workflow starting from sample preparation to data analysis for clinical samples with all the necessary precautions to be taken.

זרימת עבודה של פרוטאומיה כמותית באמצעות זיהוי מבוסס ניטור תגובה מרובה של חלבונים מרקמת המוח האנושית

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

בידוד ואפיון תאי גזע שמקורם ברקמת שומן

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in addition to their great capacity for self-renewal, migration, and proliferation. Adipose tissue is one of the least invasive and most accessible sources of mesenchymal cells. It has also been reported to have higher yields compared to other sources, as well as superior immunomodulatory properties. Recently, different procedures for obtaining adult mesenchymal cells from different tissue sources and animal species have been published. After evaluating the criteria of some authors, we standardized a methodology that is applicable to different purposes and easily reproducible. A pool of stromal vascular fraction (SVF) from perirenal and epididymal adipose tissue allowed us to develop primary cultures with optimal morphology and functionality. The cells were observed adhered to the plastic surface for 24 h, and exhibited a fibroblast-like morphology, with prolongations and a tendency to form colonies. Flow cytometry (FC) and immunofluorescence (IF) techniques were used to assess the expression of the membrane markers CD105, CD9, CD63, CD31, and CD34. The ability of adipose-derived stem cells (ASCs) to differentiate into the adipogenic lineage was also assessed using a cocktail of factors (4 &#181;M insulin, 0.5 mM 3-methyl-iso-butyl-xanthine, and 1 &#181;M dexamethasone). After 48 h, a gradual loss of fibroblastoid morphology was observed, and at 12 days, the presence of lipid droplets positive to oil red staining was confirmed. In summary, a procedure is proposed to obtain optimal and functional ASC cultures for application in regenerative medicine.

מחבר זרקור: בידוד וזיהוי של תאי גזע מזנכימליים שמקורם ברקמת שומן של חולדות Sprague Dawley  

This protocol describes a methodology for isolating and identifying adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (MSCs) from Sprague Dawley rats.

בידוד וזיהוי תאי גזע מזנכימליים שמקורם ברקמת שומן של חולדות Sprague Dawley

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in ...