Name: phospholipid mediator induced transformation in three-dimensional cultures
Uploaded: 2022-07-27T14:20:00
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Nous remercions l’installation de microscopie IISER Pune pour l’accès à l’équipement et à l’infrastructure et pour le soutien aux expériences. Cette étude a été financée par une subvention du Département de biotechnologie (DBT), du gouvernement de l’Inde (BT / PR8699 / MED / 30/1018/2013), du Science and Engineering Research Board (SERB), du gouvernement de l’Inde (EMR / 2016 / 001974) et en partie par IISER, Pune Core funding. A. K. a été financé par la bourse CSIR-SRF, L.A. a été financé par la bourse DST-INSPIRE, V.C a été financé par DBT (BT / PR8699 / MED / 30/1018/2013).

1. Ensemencement des cellules MCF10A dans lrECM
<ol><li>Maintenir les cellules MCF10A (cellules épithéliales mammaires adhérentes) dans le milieu de croissance. Passez les cellules tous les 4 jours. NOTE: Composition du milieu de croissance: DMEM à haute teneur en glucose sans pyruvate de sodium contenant du sérum de cheval (5%), insuline (10 μg/mL), hydrocortisone (0,5 μg/mL), facteur de croissance épidermique, EGF (20 ng/mL), de toxine cholérique (100 ng/mL) et pénicilline-streptomycine ...

Les modèles établis basés sur des lignées cellulaires sont largement utilisés pour étudier le processus de cancérogenèse. Les cultures monocouches de cellules continuent de fournir des informations sur les diverses voies de signalisation moléculaire qui interviennent dans les changements caractéristiques des cellules cancéreuses32. Des études sur le rôle d’oncogènes bien connus tels que Ras, Myc et p53 muté ont d’abord été rapportées en utilisant des cultures monocouches comm...

Une myriade de modèles sont disponibles pour étudier la progression du cancer, chacun d’eux étant unique et représentant un sous-type de cette maladie complexe. Chaque modèle fournit des informations uniques et précieuses sur la biologie du cancer et a amélioré les moyens d’imiter l’état réel de la maladie. Les lignées cellulaires établies cultivées en monocouche ont fourni des informations précieuses sur les processus vitaux in vitro, tels que la prolifération, l’invasivité, la migration et l’apoptose1. Bien que la culture cellulaire bidimensionnelle (2D) ait été l’outil traditionnel pour étudier la réponse des cellules de mammifères à plusieurs perturbations environnementales, l’extrapolation de ces résultats pour prédire les réponses au niveau tissulaire ne semble pas suffisamment convaincante. La principale limitation des cultures 2D est que le microenvironnement créé diffère largement de celui du tissu mammaire lui-même2. La culture 2D manque de l’interaction des cellules avec la matrice extracellulaire, ce qui est vital pour la croissance de tout tissu. De plus, les forces de traction subies par la cellule dans les cultures monocouches entravent la polarité de ces cellules, modifiant ainsi la signalisation et le comportementdes cellules 3,4,5. Les systèmes de culture tridimensionnels (3D) ont ouvert une nouvelle voie dans le domaine de la recherche sur le cancer avec leur capacité à imiter les conditions in vivo in vitro. De nombreux indices microenvironnementaux cruciaux qui sont perdus dans la culture cellulaire 2D pourraient être rétablis en utilisant des cultures 3D de matrice extracellulaire riche en laminine (lrECM)6.
Diverses études ont identifié l’importance du microenvironnement tumoral dans la cancérogenèse 7,8. Les facteurs associés à l’inflammation constituent une partie importante du microenvironnement. Le facteur d’activation plaquettaire (PAF) est un médiateur phospholipide sécrété par diverses cellules immunitaires qui médie les réponses immunitairesmultiples 9,10. Des niveaux élevés de FAP sont sécrétés par différentes lignées cellulaires de cancer du sein et sont associés à une prolifération accrue11. Des études de notre laboratoire ont montré que la présence prolongée de PAF dans les cultures acineuses entraîne la transformation des cellules épithéliales du sein12. PAF active le récepteur PAF (PAFR), activant l’axe de signalisation PI3K/Akt13. Le DPAP est également associé à l’EMT, à l’invasion et aux métastases14.
Le présent protocole démontre un système modèle pour étudier la transformation induite par le PAF, en utilisant des cultures 3D de cellules épithéliales du sein, comme cela a été décrit précédemment par Chakravarty et al.12. Les cellules épithéliales mammaires cultivées sur la matrice extracellulaire (cultures 3D) ont tendance à former des sphéroïdes polarisés arrêtés par croissance. Ceux-ci sont appelés acini et ressemblent étroitement aux acini du tissu mammaire, la plus petite unité fonctionnelle de la glande mammaire, in vivo15. Ces sphéroïdes (Figure 1A,B) sont constitués d’une monocouche de cellules épithéliales polarisées étroitement tassées entourant une lumière creuse et fixées à la membrane basale (Figure 1C). Ce processus de morphogenèse a été bien décrit dans la littérature16. Lorsqu’elles sont ensemencées sur lrECM, les cellules subissent une division et une différenciation pour former un groupe de cellules, qui se polarisent ensuite à partir du jour 4. Au jour 8, les acini sont constitués d’un groupe de cellules polarisées qui sont en contact direct avec la matrice extracellulaire et d’un groupe de cellules non polarisées enfermées dans les cellules polarisées externes, sans contact avec la matrice. Ces cellules non polarisées sont connues pour subir l’apoptose au jour 12 de la culture, formant une lumière creuse. Au jour 16, les structures arrêtées par la croissance sont formées16.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64146/64146fig01.jpg"> Figure 1 : Noyaux de cellules dans les acini colorés avec une coloration nucléaire. (A) Construction 3D des acini. (B) Image à contraste de phase de MCF10A acini cultivée sur Matrigel pendant 20 jours. (C) La section la plus centrale montre la présence d’une lumière creuse. Barre d’échelle = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64146/64146fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Contrairement aux cultures 2D, les cultures acineuses aident à distinguer les cellules normales et transformées par des changements morphologiques apparents. Les cellules épithéliales mammaires non transformées forment des acini avec une lumière creuse, imitant les acini mammaires humains normaux. Ces sphéroïdes, lors de la transformation, présentent une morphologie perturbée caractérisée par une perte importante de polarité (une des caractéristiques du cancer), l’absence de lumière ou une perturbation de la lumière creuse (due à l’évasion de l’apoptose) qui peut être induite en raison de la dérégulation de divers gènes17,18,19,20 . Ces transformations peuvent être étudiées à l’aide de techniques couramment utilisées telles que l’immunofluorescence. Ainsi, le modèle de culture cellulaire 3D peut fonctionner comme une méthode simple pour étudier le processus de morphogenèse acineuse du sein et de cancérogenèse mammaire. L’établissement d’un système de culture 3D pour comprendre l’effet d’un médiateur phospholipidique, PAF, aidera au criblage préclinique de médicaments à haut débit.
Ce travail a adapté le protocole de culture 3D 'on top' 16,21 pour étudier la transformation induite par PAF 22. Les changements phénotypiques induits par l’exposition des acini au médiateur phospholipide ont été étudiés par immunofluorescence. Divers marqueurs de polarité et de transition épithéliale à mésenchymateuse (EMT)12,16 ont été utilisés dans l’étude. Le tableau 1 mentionne leur localisation normale et leur phénotype attendu lors de la transformation.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Anticorps</td>
			<td>Marques</td>
			<td>Localisation normale</td>
			<td>Phénotype transformé</td>
		</tr><tr><td>α6-Intégrine</td>
			<td>Basolatéral</td>
			<td>Basal avec faible coloration latérale</td>
			<td>Forte tache latérale / apicale</td>
		</tr><tr><td>β-Caténine</td>
			<td>Jonction cellule-cellule</td>
			<td>Basolatéral</td>
			<td>Localisation anormale / nucléaire ou cytoplasmique</td>
		</tr><tr><td>Vimentin</td>
			<td>Emt</td>
			<td>Présence absente / faible</td>
			<td>Réglementation à la hausse</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Marqueurs utilisés dans l’étude. Différents marqueurs utilisés avec leur localisation en présence et en l’absence de traitement PAF.
Cette méthode peut être mieux utilisée pour étudier / cribler des médicaments plausibles et des gènes cibles pour divers sous-types de cancer du sein. Cela peut fournir des données de réponse aux médicaments plus proches du scénario in vivo , ce qui contribue à un développement de médicaments plus rapide et plus fiable. En outre, ce système peut être utilisé pour étudier la signalisation moléculaire associée à la réponse aux médicaments et à la résistance aux médicaments.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AA433689M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Mouse Alexa Flour 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Rabbit Alexa Flour 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber Coverglass</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>155409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052-1MG</td>
			<td>1 mg/mL in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9644-0.2MG</td>
			<td>100 mg/mL in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F(ab&#8217;)2 fragment of antibody raised in goat against mouse antigen</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>115-006-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM130 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab52649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>33258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0888</td>
			<td>1 mg/mL in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1882</td>
			<td>10 mg/mL stock dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lrECM (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting reagent (Slow fade Gold Anti-fade)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Stain&#160; (Hoechst)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>33258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAF</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>91575-58-5</td>
			<td>Methylcarbamyl PAF C-16, procured as a 10 mg/mL in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab92547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;6-integrin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1378</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phospholipid mediator induced transformation in three-dimensional cultures

Plusieurs modèles ont été développés pour étudier le cancer, tels que des modèles de rongeurs et des lignées cellulaires établies. Des études utilisant ces modèles ont fourni des informations précieuses sur la cancérogenèse. Les lignées cellulaires ont permis de comprendre la dérégulation de la signalisation moléculaire associée à la tumorigenèse du sein, tandis que les modèles de rongeurs sont largement utilisés pour étudier les caractéristiques cellulaires et moléculaires du cancer du sein in vivo. L’établissement de cultures 3D de cellules épithéliales et cancéreuses du sein aide à combler le fossé entre les modèles in vivo et in vitro en imitant les conditions in vivo in vitro. Ce modèle peut être utilisé pour comprendre la dérégulation d’événements complexes de signalisation moléculaire et les caractéristiques cellulaires au cours de la cancérogenèse mammaire. Ici, un système de culture 3D est modifié pour étudier une transformation induite par un médiateur phospholipide (facteur d’activation plaquettaire, PAF). Les immunomodulateurs et autres molécules sécrétées jouent un rôle majeur dans l’initiation et la progression de la tumeur dans le sein. Dans la présente étude, des cultures acineuses 3D de cellules épithéliales mammaires exposées au PAF présentaient des caractéristiques de transformation telles que la perte de polarité et des caractéristiques cellulaires altérées. Ce système de culture 3D aidera à faire la lumière sur les perturbations génétiques et / ou épigénétiques induites par diverses petites entités moléculaires dans le microenvironnement tumoral. En outre, ce système fournira également une plate-forme pour l’identification de gènes nouveaux et connus qui peuvent être impliqués dans le processus de transformation.

Les cellules MCF10A, lorsqu’elles sont exposées au traitement PAF, forment des structures acineuses avec des phénotypes très distincts. L’α6-intégrine s’est avérée mal localisée avec plus de coloration apicale. Quelques acini ont également montré une coloration discontinue (Figure 2A). Ces deux phénotypes indiquent la perte de polarité basale, comme en témoigne la littérature24,25. Des rapports antérieurs indique...

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Phospholipid Mediator Induced Transformation in Three-Dimensional Cultures

Le présent protocole décrit la mise en place de cultures 3D « on top » d’une lignée cellulaire épithéliale mammaire non transformée, MCF10A, qui a été modifiée pour étudier la transformation induite par le facteur d’activation plaquettaire (PAF). L’immunofluorescence a été utilisée pour évaluer la transformation et est discutée en détail.

Transformation induite par un médiateur de phospholipides dans des cultures tridimensionnelles

Several models have been developed to study cancer, such as rodent models and established cell lines. Valuable insights into carcinogenesis have been ...

Nos cultures d’essais 3D modifiées peuvent être utilisées pour étudier le rôle de divers composants dans un microenvironnement cancéreux, ce qui conduit à l’identification de nouveaux biomarqueurs et cibles médicamenteuses. Cette méthode permet d’étudier les changements dans le phénotype cellulaire et la signalisation moléculaire qui ressemblent étroitement au système immunitaire. Il peut également être modifié pour répondre aux exigences spécifiques d’une étude.Cette méthode peut aider à identifier de nouveaux biomarqueurs qui peuvent aider à la détection précoce du cancer du sein. En outre, les connaissances moléculaires peuvent être utilisées pour identifier de nouvelles cibles médicamenteuses. Cette méthode peut être utilisée pour étudier à la fois la tumorigenèse et la morphogenèse après perturbation du ou des gènes qui peuvent donner un aperçu du rôle joué par le ou les gènes.Pour commencer, trypsiniser les cellules en aspirant le milieu et en les lavant avec 2 millilitres de PBS. Ajouter 900 microlitres de trypsine-EDTA à 0,05% et incuber à 37 degrés Celsius pendant environ 15 minutes ou jusqu’à ce que les cellules soient complètement trypsinisées. Préparer un lit de lrECM dans huit puits d’une lame de verre à couvercle chambré en recouvrant chaque puits de 60 microlitres de lrECM.Placez-le dans un incubateur à dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant un maximum de 15 minutes. Pour préparer la suspension cellulaire, ajoutez 5 millilitres de milieu de remise en suspension pour éteindre l’activité de la trypsine et faites tourner les cellules à 112 fois g pendant 10 minutes à 25 degrés Celsius. Aspirer le milieu usé et remettre les cellules en suspension dans 2 millilitres de milieu de dosage.Bien mélanger la suspension pour assurer la formation d’une suspension unicellulaire. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et calculer le volume de suspension cellulaire nécessaire pour ensemencer 6 000 cellules dans chaque puits. Selon le nombre de puits requis, diluer la suspension cellulaire dans le milieu de recouvrement.Ajouter 400 microlitres de la suspension cellulaire diluée aux lrECM préparés, en veillant soigneusement à ne pas perturber le lit lrECM. Incuber à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié à 5% de dioxyde de carbone. Après 3 heures, ajoutez 200 nanomoles de PAF à chaque puits.Ajoutez la même concentration de PAF lors de chaque changement de milieu et reconstituez les cellules avec du milieu frais tous les 4 jours. Après 20 jours de culture, pipeter soigneusement le milieu de chaque puits et laver les puits avec 400 microlitres de PBS préchauffé. Fixez les structures acineuses en ajoutant 400 microlitres de paraformaldéhyde à 4% fraîchement préparé et en incubant pendant 20 minutes à température ambiante.Rincez les puits une fois avec du PBS glacé et perméabilisez avec du PBS contenant 0,5% de Triton X-100 pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius. Après 10 minutes, épongez soigneusement la solution de Triton X-100 et rincez avec 400 microlitres de glycine PBS fraîchement préparée. Ajouter 400 microlitres de la solution de blocage primaire comprenant 10% de sérum de chèvre dans un tampon d’immunofluorescence et incuber à température ambiante pendant 60 minutes.Retirez la solution de blocage primaire, ajoutez 200 microlitres d’anticorps bloquant secondaire à 2% préparé dans la solution de blocage primaire et laissez-la à température ambiante pendant 45 à 60 minutes. Préparer l’anticorps primaire dans une solution d’anticorps bloquant secondaire à 2% dans une dilution 1:100. Retirez la solution de blocage secondaire, ajoutez l’anticorps fraîchement préparé et incuber pendant la nuit à 4 degrés Celsius.Pipeter soigneusement la solution d’anticorps primaire et la laver trois fois avec 400 microlitres de tampon d’immunofluorescence. Ensuite, préparez une dilution 1:200 de l’anticorps secondaire conjugué au fluorophore dans la solution de blocage primaire et incuber les lames dans la solution d’anticorps secondaire pendant 40 à 60 minutes à température ambiante. Rincer les lames avec 400 microlitres de tampon d’immunofluorescence pendant 20 minutes, suivies de deux lavages avec du PBS pendant 10 minutes chacun.Contre-colorer les noyaux avec du PBS contenant 0,5 nanogramme par millilitre de coloration nucléaire pendant 5 à 6 minutes à température ambiante. Lavez les lames trois fois avec 400 microlitres de PBS pour enlever l’excès de tache. Extraire soigneusement le PBS entier et assurer l’élimination de la solution résiduelle.Ajoutez ensuite une goutte de réactif de montage dans chaque puits et laissez-le reposer à température ambiante pendant la nuit. Enfin, imagez les lames avec un grossissement de 40x ou 63x au microscope confocal, en prenant des coupes Z optiques de 0,6 millimètre de taille. Les images représentent les noyaux de cellules en acini colorés avec une coloration nucléaire.La construction 3D de l’acini et l’image de contraste de phase de MCF10A acini cultivé sur lrECM pendant 20 jours sont montrées ici. La section la plus centrale montre la présence d’une lumière creuse. PAF perturbe la polarité et induit des changements de type EMT dans les acini mammaires MCF10A.Les cellules MCF10A ont été cultivées en 3D sur des cultures supérieures en lrECM. Les cultures ont été traitées avec PAF les jours 0, 4, 8, 12 et 16. Les cultures ont été maintenues pendant 20 jours, puis immunocolorées pour l’alpha6-intégrine et la coloration nucléaire, GM130, un marqueur de polarité apicale, et Vimentin, un marqueur EMT.La pile la plus centrale des acini respectifs a été montrée ici. Les données représentatives concernent 40 à 50 acini provenant de trois expériences biologiquement indépendantes. Le lit lrECM doit être soigneusement fait de manière à être réparti uniformément sans bulles d’air.En outre, la suspension cellulaire doit être mélangée uniformément et ajoutée lentement pour éviter l’agglutination. On peut obtenir des protéines et de l’ARN à partir des cultures 3D qui peuvent ensuite être utilisés pour étudier les différentes voies moléculaires.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Déplacement vers le haut : Un Simple et Flexible In Vitro Invasion en trois dimensions Assay protocole

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Génération des sphéroïdes High-Throughput tumeur en trois dimensions pour le dépistage des drogues

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Un système de culture thymique tridimensionnel pour générer murine induite Pluripotent Stem Cell-dérivé Des émigrants thymiques spécifiques à l'antigène

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