Vores protokoller hjælper med at skabe genetisk modificerede mus, der kræver avancerede muse in vivo-eksperimenter, såsom visualisering af genekspression, genetisk humanisering og betinget genknockout. Musens zygote genomredigeringsteknik, der præsenteres her, muliggør meget effektiv, hurtig og enkel induktion af avancerede genetiske modifikationer, såsom genkassette knock-in og flox. Da genetisk modificerede mus anvendes inden for forskellige forskningsområder som neurologi, immunologi, stofskifte, reproduktion og infektionssygdomme, understøtter vores teknologi, der præsenteres her, grundlæggende dette brede forskningsfelt.
Demonstration af proceduren vil være Natsumi Iki, Miyuki Ishida og Yoko Tanimoto, teknisk personale fra mit laboratorium. Til at begynde med skal du forberede to 35 millimeter petriskåle til zygotekultur og placere dem i inkubatoren ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid indtil brug. Saml ovidukterne og læg dem i 20 mikroliter dråbe M2-medium indeholdende 0,75 milligram pr. Milliliter hyaluronidase på låget på petriskålen.
Brug en fin spidstang til at opsamle en ovidukt og perfusere ca. 50 mikroliter M2-medium med hyaluronidase gennem fimbriae. Efter 30 sekunder skal du ved hjælp af en glaskapillær hente morfologisk normale zygoter med en lille mængde medium og vaske dem ved at overføre dem til friske M16 mellemstore dråber. Saml derefter de vaskede zygoter i en petriskål og gentag processen, indtil alle zygoter er hentet.
Brug den programmerbare pipettetrækker til at trække i nogle glaspipetter. Knæk spidsen af mikroinjektionsnålen ved at ramme glaskuglen, der er fastgjort til microforge-spidsen. Kontroller spidsstørrelsen under et mikroskop ved 1.000x forstørrelse, og sørg for, at spidsstørrelsen på mikroinjektionsnålen er omkring en mikrometer i diameter.
Brug en microforge til at bøje mikroinjektionsnålen cirka to til tre millimeter fra spidsen. Injicer 1 til 1,5 centimeter af driftsvæsken i midten af mikroinjektionsnålen, og fastgør den til den manuelle mikroinjektorholder med piezoaktuatoren. Sæt derefter holdenålen på den modsatte manuelle mikroinjektorholder, og flyt driftsvæsken til mikroinjektionsnålens spids med gradvist tryk.
Fastgør de manuelle mikroinjektorholdere på mikromanipulatoren. Forbered et injektionskammer med tre dråber. For det første med 10 mikroliter M2-medium, for det andet med fem mikroliter 12% polyvinylpyrrolidon i M2-medium og for det tredje med fem mikroliter blanding af crRNA, tracrRNA, Cas9-protein og donor-DNA-opløsningen.
Dæk dråberne med mineralolie og sæt injektionskammeret på det omvendte mikroskoptrin. Under det omvendte mikroskop ved en 50x forstørrelse sænkes mikroinjektionspipetten ned i 12% PVP-dråben. Opsug og dispenser 12% PVP for at rengøre indersiden af mikroinjektionsnålens spids og overføre den til RNPD-dråben.
Sæt den manuelle mikroinjektor under negativt tryk. Sug RNPD-opløsningen ind i mikroinjektionskanylen, og vent, indtil der suges et tilstrækkeligt volumen. Under 50x forstørrelse fyldes hele indersiden af mikroinjektionsnålen med væske.
Stop derefter indtaget, og lad RNPD-opløsningen udvises gradvist ved at indstille den manuelle mikroinjektor til positivt tryk. Flyt spidsen af mikroinjektionsnålen ind i olien. Sæt 50 zygoter i M2-dråben og sænk forsigtigt holdepipetten ned i den samme dråbe.
Overfør mikroinjektionsnålen til M2-dråben, der indeholder zygoter. Skift til et 20x mål, og fokuser på spidsen af mikroinjektionspipetten. Efter at have holdt en zygote, fokuser på pronucleus ved at flytte mikromanipulatoren.
Indsæt mikroinjektionsnålen i zygoten og bring spidsen tæt på pronucleus. Når spidsen når pronucleusmembranen, skal du anvende piezopulsen til at gennembore. Når mikroinjektionsnålen punkterer pronucleus, injiceres RNPD-opløsningen og observeres hævelsen af pronucleus.
Når pronucleus er helt oppustet, hurtigt trække nålen ud og udføre den samme procedure på både kvindelige og mandlige pronuclei. Dyp zygoterne før og efter injektionen ved at flytte den injicerede zygote til et andet sted i M2-dråben, og fortsæt med at injicere alle zygoterne, der er til stede i M2-dråben. Efter injektionen overføres zygoterne til en frisk M16-skål.
Vælg de overlevende zygoter 10 minutter efter injektion. Fjern de lyserede zygoter, der er beskadiget af injektionen, og fordel overlevede zygoter til hver dråbe i M16-skålen. Anbring en lille mængde dyrkningsmedium, nogle luftbobler som markør og zygoterne i en pipette til overførsel.
Brug en mikroforskydning til at lave et snit mellem ampulla og oviduktens fimbriae. Indfør zygoterne i snittet og bekræft samtidig, at luftboblen er blevet introduceret. Medianproduktionseffektiviteten for 13 uafhængige genkassette-knock-in-mus var 20,8%med et maksimum på 39,5%og et minimum på 7,9%Medianfødselsraten under denne ikke-dødelige genmålretningstilstand var 34,0%med et maksimum på 43,3%og et minimum på 15,9%Medianproduktionseffektiviteten for de 10 uafhængige floksede mus var 7,7%med et maksimum på 20,7%og et minimum på 2,1%Selvom funktionerne hos flere målgener var ukendt var medianfødselsraten 30,2%med et maksimum på 43,8%og mindst 17,3%Injektionsnålens spidsdiameter bør ikke være for tynd, og trykket fra den manuelle injektor bør justeres for at sikre, at opløsningen i nålen injiceres, og at pronucleus langsomt pustes op.