Наши протоколы помогают создавать генетически модифицированных мышей, которые требуют продвинутых экспериментов на мышах in vivo, таких как визуализация экспрессии генов, генетическая гуманизация и условный нокаут генов. Представленный здесь метод редактирования генома зиготы мыши обеспечивает высокоэффективную, быструю и простую индукцию продвинутых генетических модификаций, таких как нокаут генной кассеты и флокс. Поскольку генетически модифицированные мыши используются в различных областях исследований, таких как неврология, иммунология, обмен веществ, репродукция и инфекционные заболевания, наша технология, представленная здесь, фундаментально поддерживает эту широкую область исследований.
Процедуру продемонстрируют Нацуми Ики, Миюки Исида и Йоко Танимото, технический персонал моей лаборатории. Для начала подготовьте две 35-миллиметровые чашки Петри для культивирования зиготы и поместите их в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа до использования. Соберите яйцеводы и поместите их в 20-микролитровую каплю среды М2, содержащую 0,75 миллиграмма на миллилитр гиалуронидазы, на крышку чашки Петри.
Используйте щипцы с тонким наконечником, чтобы взять один яйцевод и перфузировать около 50 микролитров среды М2 с гиалуронидазой через фимбрии. Через 30 секунд с помощью стеклянного капилляра берут морфологически нормальные зиготы с небольшим количеством среды и моют их, перенося на свежие капли среды М16. Затем поместите промытые зиготы в чашку Петри и повторяйте процесс до тех пор, пока не будут извлечены все зиготы.
Используя программируемый съемник пипеток, вытащите несколько стеклянных пипеток. Сломайте кончик иглы для микроинъекций, ударив по стеклянному шарику, прикрепленному к наконечнику микрокузницы. Проверьте размер наконечника под микроскопом при 1 000-кратном увеличении и убедитесь, что размер наконечника иглы для микроинъекций составляет около одного микрометра в диаметре.
Используйте микрокузницу, чтобы согнуть иглу для микроинъекций примерно в двух-трех миллиметрах от кончика. Введите от 1 до 1,5 сантиметров рабочей жидкости в центр иглы для микроинъекций и прикрепите ее к ручному держателю микроинжектора с помощью пьезопривода. Затем прикрепите удерживающую иглу к противоположному ручному держателю микроинжектора и переместите рабочую жидкость на кончик иглы для микроинъекций с постепенным нажимом.
Закрепите держатели ручных микроинжекторов на микроманипуляторе. Подготовьте инъекционную камеру с тремя каплями. Во-первых, с 10 микролитрами среды М2, во-вторых, с пятью микролитрами 12% поливинилпирролидона в среде М2 и в-третьих, с пятью микролитрами смеси крРНК, тракрРНК, белка Cas9 и раствора донорской ДНК.
Покройте капли минеральным маслом и установите инжекционную камеру на инвертированный столик микроскопа. Под инвертированным микроскопом при 50-кратном увеличении опустите пипетку для микроинъекций в 12%-ную каплю PVP. Аспирируйте и дозируйте 12% PVP, чтобы очистить внутреннюю часть кончика иглы для микроинъекций и перенести ее на каплю RNPD.
Поместите ручной микроинжектор под отрицательное давление. Всосите раствор РНПД в иглу для микроинъекций и дождитесь аспирации достаточного объема. При 50-кратном увеличении заполните жидкостью всю внутреннюю часть иглы для микроинъекций.
Затем прекратите впуск и дайте раствору RNPD постепенно вытесняться, установив ручной микроинжектор на положительное давление. Переместите кончик иглы для микроинъекций в масло. Поместите 50 зигот в каплю M2 и осторожно опустите удерживающую пипетку в ту же каплю.
Перенесите иглу для микроинъекций в каплю М2, содержащую зиготы. Переключитесь на 20-кратный объектив и сфокусируйтесь на кончике пипетки для микроинъекций. Удерживая зиготу, сосредоточьтесь на пронуклеусе, перемещая микроманипулятор.
Вставьте иглу для микроинъекций в зиготу и поднесите кончик близко к пронуклеусу. Как только наконечник достигнет пронуклеусной мембраны, приложите пьезоимпульс для прокалывания. Когда игла микроинъекции прокалывает пронуклеус, вводят раствор РНПД и наблюдают за набуханием пронуклеуса.
Как только пронуклеус полностью раздуется, быстро вытащите иглу и выполните ту же процедуру как на женском, так и на мужском пронуклеусе. Дифференцируйте зиготы до и после инъекции, переместив введенную зиготу в другое место в капле М2, и продолжайте вводить все зиготы, присутствующие в капле М2. После инъекции перенесите зиготы в свежую чашку М16.
Выделите выжившие зиготы через 10 минут после инъекции. Удалите лизированные зиготы, поврежденные инъекцией, и распределите выжившие зиготы по каждой капле в чашке M16. Поместите небольшое количество питательной среды, несколько пузырьков воздуха в качестве маркера и зиготы в пипетку для переноса.
С помощью микроножницы делают надрез между ампулой и фимбриями яйцевода. Введите зиготы в разрез и одновременно подтвердите, что пузырь воздуха был введен. Медианная эффективность производства 13 независимых мышей с кассетой генов составила 20,8% с максимумом 39,5% и минимумом 7,9%Средний коэффициент рождаемости при этом нелетальном целевом целевом условии генов составил 34,0% с максимумом 43,3% и минимум 15,9%Средняя эффективность производства 10 независимых флоксированных мышей составила 7,7% с максимумом 20,7% и минимум 2,1%Хотя функции нескольких генов-мишеней были Неизвестно, медианный коэффициент рождаемости составлял 30,2%с максимумом 43,8%и минимум 17,3%Диаметр наконечника инъекционной иглы не должен быть слишком тонким, а давление ручного инжектора должно быть отрегулировано, чтобы гарантировать, что раствор в игле вводится и что пронуклеус медленно надувается.
