Våra protokoll hjälper till att skapa genetiskt modifierade möss som kräver avancerade mus-in vivo-experiment, såsom visualisering av genuttryck, genetisk humanisering och villkorlig genknockout. Muszygotgenomredigeringstekniken som presenteras här möjliggör högeffektiv, snabb och enkel induktion av avancerade genetiska modifieringar, såsom genkassettknock-in och flox. Eftersom genetiskt modifierade möss används inom olika forskningsområden som neurologi, immunologi, metabolism, reproduktion och infektionssjukdomar, stöder vår teknik som presenteras här i grunden detta breda forskningsfält.
Demonstrerar proceduren kommer att vara Natsumi Iki, Miyuki Ishida och Yoko Tanimoto, teknisk personal från mitt laboratorium. Börja med att förbereda två 35 millimeter petriskålar för zygotkultur och placera dem i inkubatorn vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid tills de används. Samla äggledarna och placera dem i 20 mikroliter droppe M2-medium innehållande 0,75 milligram per milliliter hyaluronidas på locket på petriskålen.
Använd en fin spetspincett för att plocka upp en ovidukt och perfusera cirka 50 mikroliter M2-medium med hyaluronidas genom fimbrierna. Efter 30 sekunder, med hjälp av en glaskapillär, plocka upp morfologiskt normala zygoter med en liten mängd medium och tvätta dem genom att överföra dem till färska M16-medeldroppar. Slå sedan samman de tvättade zygoterna i en petriskål och upprepa processen tills alla zygoter hämtas.
Dra några glaspipetter med hjälp av den programmerbara pipettavdragaren. Bryt spetsen på mikroinjektionsnålen genom att slå på glaskulan som är fäst vid mikrosmidesspetsen. Kontrollera spetsstorleken under ett mikroskop vid 1 000x förstoring och se till att spetsstorleken på mikroinjektionsnålen är cirka en mikrometer i diameter.
Använd en microforge för att böja mikroinjektionsnålen ungefär två till tre millimeter från spetsen. Injicera 1 till 1,5 centimeter av operationsvätskan i mitten av mikroinjektionsnålen och fäst den på den manuella mikroinjektorhållaren med piezoställdonet. Fäst sedan hållnålen på den motsatta manuella mikroinjektorhållaren och flytta operationsvätskan till mikroinjektionsnålspetsen med gradvis tryck.
Fäst de manuella mikroinjektorhållarna på mikromanipulatorn. Förbered en injektionskammare med tre droppar. Först med 10 mikroliter M2-medium, för det andra med fem mikroliter 12% polyvinylpyrrolidon i M2-medium och för det tredje med fem mikroliter blandning av crRNA, tracrRNA, Cas9-protein och donator-DNA-lösningen.
Täck dropparna med mineralolja och sätt injektionskammaren på det inverterade mikroskopsteget. Under det inverterade mikroskopet vid en 50x förstoring, sänk mikroinjektionspipetten i 12% PVP-droppen. Aspirera och dosera 12% PVP för att rengöra insidan av mikroinjektionsnålspetsen och överför den till RNPD-droppen.
Sätt den manuella mikroinjektorn under negativt tryck. Sug in RNPD-lösningen i mikroinjektionsnålen och vänta tills en tillräcklig volym aspirerats. Under 50x förstoring, fyll hela insidan av mikroinjektionsnålen med vätska.
Stoppa sedan intaget och låt RNPD-lösningen gradvis drivas ut genom att ställa in den manuella mikroinjektorn på övertryck. Flytta spetsen på mikroinjektionsnålen in i oljan. Lägg 50 zygoter i M2-droppen och sänk försiktigt hållpipetten i samma droppe.
Överför mikroinjektionsnålen till M2-droppen som innehåller zygoter. Byt till ett 20x-mål och fokusera på spetsen på mikroinjektionspipetten. Efter att ha hållit en zygot, fokusera på pronucleus genom att flytta mikromanipulatorn.
Sätt in mikroinjektionsnålen i zygoten och bringa spetsen nära pronucleus. När spetsen når pronucleusmembranet, applicera piezopulsen på piercing. När mikroinjektionsnålen punkterar pronucleus, injicera RNPD-lösningen och observera svullnaden i pronucleus.
När pronucleus är helt uppblåst, dra snabbt ut nålen och utför samma procedur på både kvinnliga och manliga pronuclei. Differentiera zygoterna före och efter injektionen genom att flytta den injicerade zygoten till en annan plats i M2-droppen och fortsätt injicera alla zygoter som finns i M2-droppen. Efter injektionen, överför zygoterna till en ny M16-skål.
Välj de överlevda zygoterna 10 minuter efter injektionen. Ta bort de lyserade zygoterna som skadats av injektionen och fördela överlevande zygoter till varje droppe i M16-skålen. Placera en liten mängd odlingsmedium, några luftbubblor som markör och zygoterna i en pipett för överföring.
Använd en mikroskjuvning, gör ett snitt mellan ampulla och fimbriae av äggledaren. För in zygoterna i snittet och bekräfta samtidigt att luftbubblan har införts. Medianproduktionseffektiviteten för 13 oberoende genkassettknock-in-möss var 20,8% med högst 39,5% och minst 7,9%Medianfödelsetalen under detta icke-dödliga geninriktningstillstånd var 34,0% med högst 43,3% och minst 15,9%Medianproduktionseffektiviteten för de 10 oberoende floxade mössen var 7,7% med högst 20,7% och minst 2,1%Även om funktionerna hos flera målgener var okänd, var medianfödelsetalen 30,2% med högst 43,8% och minst 17,3%Injektionsnålens spetsdiameter bör inte vara för tunn och trycket på den manuella injektorn bör justeras för att säkerställa att lösningen i nålen injiceras och att pronucleus långsamt blåses upp.
