هذا هو أول بروتوكول محسن لعزل النوى عالية الجودة لتجارب التسلسل أحادي النواة باستخدام أدمغة مجمدة من سمك كيليفيش الفيروزي الأفريقي ، وهو نموذج فقاري ناشئ لأبحاث الشيخوخة. يعزل هذا البروتوكول النوى بلطف شديد مما يميزها عن البروتوكولات الأكثر قسوة المحسنة للكائنات الحية الأخرى ذات الأدمغة الأكثر ميالين ، مما يؤدي إلى تدهور النوى عند استخدامها في كيليفيش. ستكون هذه الطريقة مفيدة في مساعدتنا على فهم شيخوخة الدماغ على مستوى الخلية الواحدة.
يجب أن تترجم جيدا إلى الأنسجة الأخرى التي تتطلب عزلا لطيفا للنواة. هذا البروتوكول سهل الاستخدام. المهمة الأكثر تطلبا هي الطرد المركزي المتدرج لإزالة الحطام ، حيث من الأفضل أن تكون بطيئا ودقيقا من السرعة والفوضى.
سيوضح الإجراء آري أدلر وبريان تيفي ، فني مختبر أبحاث وباحث ما بعد الدكتوراه من مختبر بن عيون. بعد تشريح سمك الكيلي ، قم بإذابة أنسجة المخ المجمدة على الجليد لمدة 10 دقائق وقم بتدسيس الدماغ في ملليلتر واحد من محلول تحلل النوى الجليدية الباردة في خالط دنس سعة 2 ملليلتر. أثناء تحلل العينة ، احتفظ بالخالط على الجليد وتجنب توليد الفقاعات.
قم بتدسيس المنديل كما هو موضح في المخطوطة واترك العينة تستقر على الثلج في الخالط لمدة دقيقتين. بعد ذلك ، صفي العينة من خلال مرشح خلية 70 ميكرومتر في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر مطلي مسبقا بنسبة 5٪ BSA. أضف أربعة ملليلتر من محلول غسيل النوى إلى العينة عن طريق سحب المخزن المؤقت للغسيل فوق مرشح الخلية 70 ميكرومتر واخلطه عن طريق قلب الأنبوب برفق خمس مرات.
باستخدام دوار دلو متأرجح ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 500 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية عن طريق سكبها برفق في وعاء النفايات السائلة. حافظ على العينة في وضع مستقيم وقم بإزالة مخزن الغسيل المتبقي باستخدام ماصة P1000.
أعد تعليق النوى على الفور في ملليلتر واحد من المخزن المؤقت لغسل النوى بطرف ماصة P1000 واسع التجويف. بعد ذلك ، احضر العينة إلى خمسة ملليلتر بإضافة أربعة ملليلترات من محلول غسل النوى واخلطها كما هو موضح سابقا. بيليه الخلية عن طريق الطرد المركزي.
تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق النوى في ملليلتر واحد من المحلول المؤقت لغسل النوى بطرف ماصة عريض التجويف. الآن ، انقل النوى إلى أنبوب قياس التدفق الخلوي. أضف 300 ميكرولتر من محلول إزالة الحطام إلى معلق الخلية واخلطه جيدا عن طريق السحب بطرف تجويف عريض حتى يصبح الخليط متجانسا.
أمسك الأنبوب بزاوية طفيفة ، وقم بتراكب ملليلتر واحد من المخزن المؤقت لغسل النوى برفق أعلى محلول النوى باستخدام ماصة P1000. جهاز طرد مركزي للعينة في دوار دلو متأرجح عند 3000 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. تخلص تماما من المرحلتين العلويتين باستخدام ماصة P1000.
انقل الطبقة السفلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر مطلي مسبقا بنسبة 5٪ BSA. بعد ذلك ، ارفع الحجم إلى 15 ملليلتر مع محلول غسيل النوى واخلطه عن طريق قلب الأنبوب ثلاث مرات. جهاز طرد مركزي للأنبوب عند 1000 جرام لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية في دوار دلو متأرجح.
قم بإزالة المادة الطافية بعناية وأعد تعليق الحبيبات على الفور في 150 ميكرولتر من محلول غسيل النوى باستخدام طرف ماصة عريض التجويف. قم بالتبديل إلى طرف ماصة تجويف قياسي مضبوط على 300 ميكرولتر. ماصة العينة بأكملها ثم قم بتوصيل مرشح 40 ميكرومتر على الطرف بنهاية طرف الماصة.
قم بتصفية العينة عن طريق طرد العينة بقوة من خلال المرشح إلى أنبوب طرد مركزي دقيق منخفض الارتباط بالحمض النووي سعة 1.5 ملليلتر. في أنبوب FACS ، أعد تعليق 10 ميكرولتر من عينة النوى المفلترة في 90 ميكرولتر من مخزن قياس التدفق الخلوي الموصى به. قم بتلطيخ العينات باستخدام يوديد البروبيديوم بتركيز نهائي قدره ميكروغرام واحد لكل ملليلتر.
بعد إعداد مساحة العمل كما هو موضح في المخطوطة ، ابدأ التدفق بالضغط على أيقونة التشغيل في الزاوية اليمنى السفلية. تحقق من وجود فقاعات هواء أو كتل في العينة باستخدام منطقة التشتت الجانبية مقابل HDRT. تحقق أيضا من مخطط التشتت الجانبي مقابل مخطط التشتت الأمامي للتحقق من تراكم الأحداث داخل حدود النافذة.
للحصول على عرض مكبر، انقر نقرا مزدوجا فوق منطقة التشتت الجانبية مقابل مخطط PerCP-Vio700-A. انقر فوق الزر الموجود على شريط الأدوات الأيسر العلوي بخط عمودي لتحديد بوابة رباعية. بعد ذلك ، انقر في أي مكان في منطقة التشتت الجانبية مقابل مخطط PerCP-Vio700-A ، وستظهر الأرباع داخل قطعة الأرض.
انقر في أي مكان على الخطوط الفاصلة الرباعية وحرك المؤشر لتعديل موضع الربع. ضع الأرباع بحيث يحتوي الربع العلوي الأيسر على حطام ويحتوي الربع الأيمن العلوي على نوى. انقر على المربع ، الرمادي ، أنا رمز لفتح نافذة الخصائص.
انتقل إلى علامة التبويب وظائف المنطقة وتأكد من وجود علامة اختيار خضراء بجوار العنصر العلوي ، مما يشير إلى تحديد قطعة الأرض بأكملها. ضمن قائمة الوظائف ، انقر فوق العد لكل ميكرولتر لإنتاج علامة اختيار خضراء. انقر فوق موافق ، وسيعرض كل ربع عددا لكل مقياس ميكرولتر.
حدد العدد والنسبة المئوية الإجمالية من علامة تبويب وظائف المنطقة لعرض الأعداد الأولية والنسب المئوية إذا رغبت في ذلك. ارسم بوابة متعددة الأضلاع حول هذه المجموعة السكانية بالنقر فوق زر المضلع في شريط الأدوات العلوي الأيسر. ثم انقر مرة واحدة وحرك الماوس لرسم جزء خطي من البوابة.
انقر مرة أخرى لإنهاء وبدء المرحلة التالية ، متبوعا بالنقر المزدوج لإنهاء البوابة. انقر فوق حد البوابة وحرك الماوس لتغيير موضع البوابة. انقر فوق رؤوس البوابة لتعديل الشكل ، وستظهر الأعداد لكل ميكرولتر من السكان المسورين.
النوى السليمة التي ظهرت كنوى مفردة ذات أغشية سليمة مناسبة للتحليل النهائي. ومع ذلك ، تتميز النوى غير الصحية بأغشية نووية تالفة ، مما يؤدي إلى تكتل النوى ويمكن أن يساهم في إشارات الخلفية في التطبيقات النهائية. تكون النوى في أشكال مفردة ومضاعفة في الربع الأيمن العلوي ، مع المفردات باعتبارها أدنى سحابة من الأحداث تليها الثنائيات والثلاثة الثلاثية بترتيب تصاعدي.
يتم تمييز الحطام بالأحداث في الربعين الموجودين في أقصى اليسار في إعداد نوى منخفضة الجودة حيث تم حذف خطوة إزالة الحطام. يشكل الحطام أكثر من 40٪ من الأحداث. ومع ذلك ، في تجربة عالية الجودة ، يشكل الحطام أقل من 15٪ من جميع الأحداث.
من الضروري إزالة الطبقة الوسطى تماما باتباع خطوة الطرد المركزي لإزالة الحطام لتقليل تلوث خلفية الحمض النووي الريبي يمكن استخدام النوى المعزولة باستخدام هذا البروتوكول لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة أو تسلسل ATAC للحصول على معلومات نسخية وجينية على مستوى خلية واحدة. ستسمح هذه التقنية للباحثين باستكشاف تنظيم الجينات في الدماغ على مستوى الخلية الواحدة في سمك كيليفيش الفيروزي الأفريقي ، وهو كائن نموذجي للفقاريات قصير العمر بشكل طبيعي لأبحاث الشيخوخة.
