Zachte isolatie van kernen uit het hersenweefsel van volwassen Afrikaanse turquoise killivissen, een natuurlijk kortlevend model voor verouderingsonderzoek

Dit is het eerste geoptimaliseerde protocol voor het isoleren van hoogwaardige kernen voor single-nuclei sequencing experimenten met behulp van bevroren hersenen van Afrikaanse turquoise killifish, een opkomend gewerveld model voor verouderingsonderzoek. Dit protocol isoleert kernen heel voorzichtig, wat het onderscheidt van hardere protocollen die zijn geoptimaliseerd voor andere organismen met meer gemyeliniseerde hersenen, wat resulteert in afgebroken kernen bij gebruik in de killifish. Deze methode zal ons helpen hersenveroudering op eencellig niveau te begrijpen.

Het zou zich goed moeten vertalen naar andere weefsels die meer zachte kernisolatie vereisen. Dit protocol is gebruiksvriendelijk. De meest veeleisende taak is de gradiëntcentrifugatie voor het verwijderen van puin, waarbij het beter is om langzaam en nauwkeurig te zijn dan snel en rommelig.

Ari Adler en Brian Teefy, een onderzoekslaboratoriumtechnicus en een postdoctoraal geleerde van het Benayoun-laboratorium, zullen de procedure demonstreren. Na het ontleden van de killifish, ontdooi het bevroren hersenweefsel op ijs gedurende 10 minuten en verdubbel de hersenen in één milliliter ijskoude kernenlysisbuffer in een twee milliliter dounce homogenisator. Houd tijdens het lozen van het monster de homogenisator op ijs en vermijd het genereren van bubbels.

Verdubbel het weefsel zoals beschreven in het manuscript en laat het monster twee minuten op ijs rusten in de dounce homogenisator. Zeef vervolgens het monster door een celfilter van 70 micrometer in een conische buis van 15 milliliter, vooraf gecoat met 5% BSA. Voeg vier milliliter kernenwasbuffer toe aan het monster door de wasbuffer over het celfilter van 70 micrometer te pipetteren en meng door de buis vijf keer voorzichtig om te keren.

Gebruik een zwenkbakrotor om het monster gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius op 500 G te centrifugeren. Gooi het supernatant weg door het voorzichtig in een vloeibaar afvalrecipiënt te gieten. Houd het monster rechtop en verwijder de resterende wasbuffer met een P1000-pipet.

Reuspendeer de kernen onmiddellijk in één milliliter kernwasbuffer met een P1000-pipetpunt met brede boring. Breng vervolgens het monster op vijf milliliter door vier milliliter kernenwasbuffer toe te voegen en te mengen zoals eerder aangetoond. Pellet de cel door centrifugatie.

Gooi het supernatant weg en resuspenseer de kernen in één milliliter kernenwasbuffer met een pipetpunt met brede boring. Breng nu de kernen over naar een flowcytometriebuis. Voeg 300 microliter puinverwijderingsoplossing toe aan de celsuspensie en meng deze grondig door te pipetteren met een punt met brede boring totdat het mengsel homogeen is.

Houd de buis in een lichte hoek en leg voorzichtig een milliliter kernwasbuffer op de kernoplossing met behulp van een P1000-pipet. Centrifugeer het monster in een zwenkbakrotor bij 3000 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Gooi de bovenste twee fasen volledig weg met een P1000-pipet.

Breng de onderste laag over op een conische buis van 15 milliliter, voorgecoat met 5% BSA. Breng vervolgens het volume op 15 milliliter met kernenwasbuffer en meng door de buis driemaal om te keren. Centrifugeer de buis op 1000G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius in een zwenkende emmerrotor.

Verwijder het supernatant voorzichtig en resuspenseer de pellet onmiddellijk in 150 microliter kernen wasbuffer met behulp van een pipetpunt met brede boring. Schakel over naar een standaard pipetpuntset met boring op 300 microliter. Pipetteer het hele monster en bevestig vervolgens een 40-micrometer on-tip filter aan het einde van de pipetpunt.

Filtreer het monster door het monster krachtig door het filter te verdrijven in een lage DNA-bindende microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Resuspendeer in een FACS-buis 10 microliter van het gefilterde kernmonster in 90 microliter van de aanbevolen flowcytometriebuffer. Kleur de monsters met propidiumjodide in een eindconcentratie van één microgram per milliliter.

Nadat u de werkruimte hebt ingesteld zoals beschreven in het manuscript, start u de stroom door op het afspeelpictogram in de rechterbenedenhoek te drukken. Controleer op luchtbellen of klonten in het monster met behulp van het zijverstrooiingsgebied versus HDRT. Controleer ook de zijverstrooiing versus voorwaartse spreidingsplot om te controleren of de gebeurtenissen zich binnen de grenzen van het venster ophopen.

Voor een vergrote weergave dubbelklikt u op het zijspreidingsgebied versus de perCP-Vio700-A-plot. Klik op de knop op de werkbalk linksboven met een loodrechte lijn om een kwadrantpoort te selecteren. Klik vervolgens ergens in het zijverstrooiingsgebied versus PerCP-Vio700-A-plot en er verschijnen kwadranten in het plot.

Klik ergens op de kwadrantscheidingslijnen en schuif met de cursor om de plaatsing van het kwadrant te wijzigen. Plaats de kwadranten zodanig dat het kwadrant linksboven puin bevat en het kwadrant rechtsboven kernen. Klik op het vierkant, grijs, ik pictogram om het eigenschappenvenster te openen.

Ga naar het tabblad regiofuncties en zorg voor een groen vinkje naast het bovenste item, dat aangeeft dat het hele perceel is geselecteerd. Klik onder de lijst met functies op telling per microliter om een groen vinkje te maken. Klik op OK en elk kwadrant geeft een telling per microliter-statistiek weer.

Selecteer aantal en procenttotaal op het tabblad regiofuncties om desgewenst onbewerkte tellingen en percentages weer te geven. Teken een veelhoekige poort rond deze populatie door op de veelhoekknop op de werkbalk linksboven te klikken. Klik vervolgens op een enkele keer en schuif met de muis om een lineair segment van de poort te tekenen.

Klik nogmaals om de volgende te voltooien en te beginnen, gevolgd door een dubbelklik om de poort te voltooien. Klik op de rand van de poort en schuif met de muis om de poort te verplaatsen. Klik op de hoekpunten van de poort om de vorm te wijzigen en er verschijnen tellingen per microliter van de gated populatie.

Gezonde kernen die verschenen als singletkernen met intacte membranen zijn geschikt voor stroomafwaartse analyse. Ongezonde kernen worden echter gekenmerkt door beschadigde kernmembranen, wat leidt tot klonteren van kernen en kan bijdragen aan achtergrondsignalen in downstream-toepassingen. Kernen zijn in singlet- en multipletvormen in het kwadrant rechtsboven, met singlets als de laagste wolk van gebeurtenissen gevolgd door doubletten en drielingen in oplopende volgorde.

Puin wordt gekenmerkt door gebeurtenissen in de twee meest linkse kwadranten in een kernpreparaat van lage kwaliteit waarbij de stap voor het verwijderen van puin werd weggelaten. Puin maakt meer dan 40% van de gebeurtenissen uit. In een hoogwaardig experiment maakt puin echter minder dan 15% van alle gebeurtenissen uit.

Het is absoluut noodzakelijk om de middelste laag volledig te verwijderen na de centrifugatiestap voor het verwijderen van puin om het vervuilen van achtergrond-RNA te verminderen Nuclei geïsoleerd met behulp van dit protocol kunnen worden gebruikt voor single-nuclei RNA-sequencing of ATAC-sequencing om transcriptomische en epigenetische informatie op eencellig niveau te verkrijgen. Deze techniek stelt onderzoekers in staat om hersengenregulatie op eencellig niveau te onderzoeken in de Afrikaanse turquoise killifish, een van nature kortlevend gewerveld modelorganisme voor verouderingsonderzoek.