これは、老化研究のための新しい脊椎動物モデルであるアフリカターコイズメダカの凍結脳を使用した単一核シーケンシング実験のために高品質の核を分離するための最初の最適化されたプロトコルです。このプロトコルは核を非常に穏やかに分離し、より有髄化した脳を持つ他の生物に最適化されたより厳しいプロトコルとは区別され、メダカで使用すると核が劣化します。この方法は、単一細胞レベルで脳の老化を理解するのに役立ちます。
それは、より穏やかな核分離を必要とする他の組織にうまく翻訳されるはずです。このプロトコルはユーザーフレンドリーです。最も要求の厳しい作業は、破片除去のためのグラジエント遠心分離であり、高速で厄介な作業よりも、ゆっくりと正確である方が良いです。
手順を実演するのは、アリ・アドラーとブライアン・ティーフィー、研究室の技術者であり、ベナユン研究所のポスドク学者です。メダカを解剖した後、凍結した脳組織を氷上で10分間解凍し、2ミリリットルのダウンスホモジナイザーで1ミリリットルの氷冷核溶解バッファーで脳を浸します。サンプルを溶解している間は、ホモジナイザーを氷の上に保ち、気泡が発生しないようにしてください。
原稿に記載されているように組織をダウンスし、サンプルをダウンスホモジナイザーで氷上に2分間置きます。次に、サンプルを70マイクロメートルのセルフィルターを通して、5%BSAでプレコートされた15ミリリットルのコニカルチューブに入れます。洗浄バッファーを70マイクロメートルのセルフィルター上でピペッティングしてサンプルに4ミリリットルの核洗浄バッファーを加え、チューブを5回穏やかに反転させて混合します。
スイングバケットローターを使用して、サンプルを500 Gで摂氏4度で10分間遠心分離します。上清を廃液容器にそっと注いで廃棄します。サンプルを直立させたまま、P1000ピペットを使用して残りの洗浄バッファーを除去します。
直ちに、広口径P1000ピペットチップを備えた1ミリリットルの核洗浄バッファーに核を再懸濁します。次に、4ミリリットルの核洗浄バッファーを加えてサンプルを5ミリリットルにし、前述のように混合します。遠心分離によって細胞をペレット化する。
上清を廃棄し、広口径ピペットチップを備えた1ミリリットルの核洗浄バッファーに核を再懸濁します。次に、核をフローサイトメトリーチューブに移します。300マイクロリットルの破片除去溶液を細胞懸濁液に加え、混合物が均一になるまで広い口径の先端でピペッティングして完全に混合します。
チューブをわずかな角度で持ち、P1000ピペットを使用して核溶液の上に1ミリリットルの核洗浄バッファーを静かに重ねます。サンプルを3000 Gのスイングバケットローターで摂氏4度で10分間遠心分離します。P1000ピペットを使用して、上部の2つのフェーズを完全に廃棄します。
最下層を5%BSAでプレコートされた15ミリリットルの円錐管に移します。次に、核洗浄バッファーで容量を15ミリリットルにし、チューブを3回反転させて混合します。チューブを1000Gで、スイングバケットローターで摂氏4度で10分間遠心分離します。
上清を注意深く取り除き、広口径ピペットチップを使用してペレットを150マイクロリットルの核洗浄バッファーに直ちに再懸濁します。300マイクロリットルに設定された標準ボアピペットチップに切り替えます。サンプル全体をピペットし、40マイクロメートルのオンチップフィルターをピペットチップの端に取り付けます。
サンプルをフィルターを通して低DNA結合の1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに強制的に排出することにより、サンプルをろ過します。FACSチューブで、ろ過した核サンプル10マイクロリットルを推奨フローサイトメトリーバッファー90マイクロリットルに再懸濁します。ヨウ化プロピジウムでサンプルを1ミリリットルあたり1マイクログラムの最終濃度で染色します。
原稿に記載されているようにワークスペースを設定したら、右下の再生アイコンを押してフローを開始します。HDRTに対する側方散乱領域を使用して、サンプル内の気泡または塊を確認します。また、側方散布図と前方散布図をチェックして、イベントがウィンドウの境界内に蓄積されていることを確認します。
拡大表示するには、PerCP-Vio700-Aに対する側方散布図をダブルクリックします。左上のツールバーの垂直線の付いたボタンをクリックして、象限ゲートを選択します。次に、PerCP-Vio700-Aプロットに対する側方散布領域の任意の場所をクリックすると、プロット内に象限が表示されます。
象限の分割線上の任意の場所をクリックし、カーソルをスライドして象限の配置を変更します。左上の象限に破片が含まれ、右上の象限に原子核が含まれるように象限を配置します。四角い灰色のIアイコンをクリックして、プロパティウィンドウを開きます。
領域関数タブに移動し、プロット全体が選択されていることを示す緑色のチェックマークが一番上の項目の横にあることを確認します。関数リストの下で、マイクロリットルあたりのカウントをクリックして、緑色のチェックマークを生成します。[OK] をクリックすると、各象限にマイクロリットルあたりのメトリック数が表示されます。
必要に応じて、領域関数タブからカウントと合計パーセントを選択して、生の数とパーセンテージを表示します。この人口の周囲にポリゴン ゲートを描画するには、左上のツールバーのポリゴン ボタンをクリックします。次に、1 回クリックしてマウスをスライドさせ、ゲートの直線セグメントを描画します。
もう一度クリックして終了し、次のゲートを開始し、続いてダブルクリックしてゲートを終了します。ゲートの境界をクリックし、マウスをスライドさせてゲートの位置を変更します。ゲートの頂点をクリックして形状を変更すると、ゲート母集団のマイクロリットルあたりのカウントが表示されます。
無傷の膜を持つ一重項核として現れた健康な核は、下流の分析に適しています。しかし、不健康な核は核膜の損傷を特徴としており、核の凝集につながり、下流のアプリケーションでバックグラウンドシグナルに寄与する可能性があります。核は右上の象限で一重項と多重項の形をしており、一重項がイベントの最低の雲であり、昇順でダブレットとトリプレットがそれに続きます。
デブリは、デブリ除去ステップが省略された低品質の原子核準備の左端の2つの象限のイベントによってマークされます。破片はイベントの40%以上を占めています。ただし、高品質の実験では、破片はすべてのイベントの15%未満を占めています。
このプロトコルを使用して単離された汚染バックグラウンドRNA核を減らすために、デブリ除去遠心分離ステップの後に中間層を完全に除去することが不可欠です。 単一核RNAシーケンシングまたはATACシーケンシングに使用して、シングルセルレベルのトランスクリプトームおよびエピジェネティック情報を取得できます。この技術により、研究者は、老化研究のための自然に短命の脊椎動物モデル生物であるアフリカターコイズメダカの単一細胞レベルで脳遺伝子制御を探索することができます。
