Dechiffrera högupplöst 3D-kromatinorganisation via Capture Hi-C

Capture Hi-C gör det möjligt att dechiffrera 3D-kromatinorganisationen av genomiska regioner av intresse i megabasstorlek med hög upplösning. Med Capture Hi-C uppnås högre upplösning och allelspecificitet samtidigt som teknikens tidseffektivitet och överkomlighet förbättras. Tillämpningen av Capture IC på olika modellsystem, celltyper och utvecklingsreglerade kromatinlandskap vid hälso- och patologiska tillstånd kommer sannolikt att underlätta vår förståelse av samspelet mellan genomtopologi och genreglering.

Till att börja med, tryftonisera och räkna celler från kontrollplattan förberedd speciellt för cellräkning med hjälp av en automatiserad cellräknare. Inkludera viabilitetsfärgning för att bestämma procentandelen livskraftiga celler. Från detta cellantal, uppskatta det totala antalet celler i plattan förberedd för tvärbindning.

Ta bort odlingsmediet från plattorna förberedda för tvärbindning och ersätt det med fixeringslösningen. Fixera i 10 minuter vid rumstemperatur under försiktig blandning på en shaker. Släck den fasta reaktionen genom att tillsätta 2,5 molar glycin PBS till en slutlig koncentration av 0,125 molarer.

Tillsätt 530 mikroliter 2,5 molar glycin PBS till 10 ml i en 10 centimeter platta. Inkubera i fem minuter vid rumstemperatur, blanda försiktigt på en shaker. Överför plattorna till is och inkubera i ytterligare 15 minuter på is medan du försiktigt blandar på en skakapparat.

Ta bort fixeringslösningen från cellerna genom att hälla den i en bägare för att säkerställa snabb hantering. Skölj 10 centimeter plattan snabbt två gånger med fem milliliter kall 0,125 molar glycin PBS för att tvätta bort skräp och döda celler. Ta bort vätskan från plattan genom att hälla den i en bägare för att säkerställa snabb hantering.

Tillsätt fem milliliter kall 0,125 molar glycin PBS till 10 centimeterplattan. Och skrapa snabbt cellerna från plattan med en plastcellskrapa. Överför cellsuspensionen till ett förkylt 50 ml koniskt centrifugrör med hjälp av en serologisk pipett.

Skölj plattan två gånger med fem milliliter kall 0,125 molar glycin PBS och tillsätt cellsuspensionen till det koniska centrifugröret. Snurra ner vid 480 G i 10 minuter vid fyra grader Celsius. Ta bort supernatanten genom att aspirera med ett bänkaspirationssystem.

Återsuspendera cellerna och alikvot 500 mikroliter av cellsuspensionen till det beräknade antalet 1,5 ml mikrocentrifugrör. Snurra ner vid 480 gånger G i 10 minuter vid fyra grader Celsius och förvara torrcellspellets vid 80 grader Celsius. För celllys, tina de frysta pelletsna på is.

Förbered 1,5 ml lysbuffert i vatten. Tillsätt 600 mikroliter av kalllysbufferten och suspendera väl på is. Snurra ner vid 2 655 G i fem minuter vid fyra grader Celsius och ta bort supernatanten med ett bänkaspirationssystem.

Resuspendera i 100 mikroliter 0,5% SDS. Efter inkubation vid 62 grader Celsius virvlande vid 1400 rpm i 10 minuter, tillsätt 290 mikroliter vatten plus 50 mikroliter 10% Triton X 100 och blanda väl, undvik luftbubblor. Inkubera vid 37 grader Celsius med virvlande vid 1400 varv / min i 10 minuter innan du tillsätter 50 mikroliter 10 X DPN-rörbuffert och invertera röret för att blanda.

Ta 50 mikroliter osmält DNA för kvalitetskontroll i ett separat rör. Glöm inte att ta det osmälta kontrollprovet. För DPN2-matsmältning, tillsätt 10 mikroliter DPN2 hög koncentration och blanda genom att invertera.

Inkubera proverna och den osmälta kontrollen i en termisk mixer vid 37 grader Celsius, virvla med 1400 varv per minut i mer än fyra timmar. För ligering och reversering av tvärbindning, ta 50 mikroliter av det ligerade smälta DNA för kvalitetskontroll i ett separat rör. Förvara de osmälta och oligerade kontrollerna vid 20 grader Celsius.

Tillsätt 800 mikroliter ligeringscocktail. Inkubera vid 16 grader Celsius, virvla med 1000 varv per minut över natten. För DNA-rening, överför proverna på is till förkylda 15 ml koniska centrifugrör och tillsätt två milliliter vatten, 10,5 ml iskall etanol och 583 mikroliter tre molar natriumacetat.

Tillsätt 200 mikroliter iskall etanol, 10,8 mikroliter natriumacetat och en mikroliter coprecipitant till de osmälta och ligerade kvalitetskontrollerna. Inkubera vid minus 80 grader Celsius i minst fyra timmar upp till natten. Snurra 15 milliliterrören vid 2200 G vid fyra grader Celsius i 45 minuter.

Avlägsna försiktigt etanol och lufttorka proverna och kontrollerna vid rumstemperatur i 10 till 15 minuter. Överdriv inte. Resuspendera proverna och kontrollerna i 100 mikroliter respektive 20 mikroliter vatten.

För kvalitetskontroll av 3C-mallberedning, ladda 100 till 200 nanogram av varje prov och varje kontroll på en 1% agros 1XTBE-gel. För att utföra målanrikning för avskalad multiplexsekvensering, ta fyra mikrogram 3C-mall, resuspendera den i 130 mikroliter vatten för varje infångningsreaktion. Sonicate provet och fortsätta beredningen med tre mikrogram av det skjuvade DNA.

För att hybridisera de beredda DNA-proverna till de målspecifika RNA-sonderna, använd 750 nanogram DNA-prover i en slutlig volym på 3,4 mikroliter, vilket resulterar i en initial koncentration av 221 nanogram per mikroliter. Använd vakuumkoncentration om det behövs för att uppnå den slutliga volymen på 3,4 mikroliter. För prover som återsuspenderas i 10 mikroliter är 15 till 20 minuters koncentration tillräcklig.

Inkubera hybridiseringsblandningen i 16 till 18 timmar vid 65 grader Celsius med ett uppvärmt lock vid 105 grader Celsius, enligt tillverkarens instruktioner. För att fånga de riktade ligeringsfragmenten, tillsätt streptivid i kopplade pärlor till det sondhybridiserade provet. Slutligen, för att förbereda proverna för multiplexsekvensering, fortsätt protokollet enligt målanrikningssystemet som används i denna studie för parad och multiplexerad sekvensering.

Upplösningen på interaktionskartan Capture Hi-C gör det möjligt att identifiera två mindre domäner i Tsix-tad som innehåller promotorn för Tsix-lokusen. Detta uppnåddes inte tidigare med 5C. Dessutom är andra sub-tad-strukturer, såsom kontaktslingor, tydligt synliga från Capture Hi-C-data, såsom slingan mellan Xist och FTX, som tidigare identifierats med Capture C och slingan mellan Xist och Xert som nyligen identifierades med ett liknande protokoll för Capture Hi-C.

Andra kontakter kan också kartläggas mer exakt på grund av den ökade upplösningen av Capture Hi-C-profilerna, såsom de som bildar de kända kontakthotspotsna inom Tsix-tad mellan Linx, Chic1 och Xite loci. I jämförelse med de visade Hi-C-data tillät Capture Hi-C en fyrfaldig ökning av upplösningen, men det krävde bara en fjärdedel av sekvenseringsdjupet. Det är mycket viktigt att inte glömma att ta 50 mikroliter osmält och oligerad DNA-prover som kvalitetskontroll för 3C-mallberedningen.