Name: in vivo vascular permeability detection in mouse submandibular gland
Uploaded: 2022-08-04T14:00:00
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Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (Zuschüsse 31972908, 81991500, 81991502, 81771093 und 81974151) und der Beijing Natural Science Foundation (Grant 7202082) unterstützt.

Alle experimentellen Verfahren wurden von der Ethikkommission für Tierforschung des Gesundheitswissenschaftlichen Zentrums der Universität Peking genehmigt und entsprachen dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (NIH-Publikation Nr. 85-23, überarbeitet 1996). Für die vorliegende Studie wurden männliche Wildtyp-Mäuse (WT) in der Altersgruppe von 8-10 Wochen verwendet. Die Versuchstiere wurden sorgfältig behandelt, um ihre Schmerzen und Beschwerden zu minimieren.
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Die Aufrechterhaltung und Regulierung der endothelialen Barrierefunktion sind essentiell für die vaskuläre Homöostase. Endothelzellen und ihre interzellulären Verbindungen spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung und Kontrolle der vaskulären Integrität12. Die Scherkraft des Blutflusses, Wachstumsfaktoren und Entzündungsfaktoren können Veränderungen der vaskulären Permeabilität verursachen und somit am Auftreten und der Entwicklung systemischer Erkrankungen wie Bluthoch...

Verschiedene Speicheldrüsen produzieren Speichel, der in erster Linie als erste Verteidigungslinie gegen Infektionen fungiert und die Verdauung unterstützt und dadurch eine wesentliche Rolle für die Mund- und allgemeine Gesundheit spielt1. Die Blutversorgung ist entscheidend für die Speicheldrüsensekretion, da sie ständig Wasser, Elektrolyte und Moleküle liefert, die den primären Speichel bilden. Die endotheliale Barrierefunktion, die durch den Tight Junction (TJ)-Komplex reguliert wird, begrenzt streng und empfindlich die Permeation von Kapillaren, die für Wasser, gelöste Stoffe, Proteine und sogar Zellen, die sich von den zirkulierenden Blutgefäßen in das Speicheldrüsengewebe bewegen, sehr durchlässig sind 2,3. Wir haben bereits festgestellt, dass die Öffnung der endothelialen TJs als Reaktion auf einen cholinergen Reiz die Speichelsekretion erleichtert, während die Beeinträchtigung der endothelialen Barrierefunktion mit Hyposekretion und lymphatischer Infiltration in den submandibulären Drüsen (SMGs) beim Sjögren-Syndrom4 verbunden ist. Diese Daten deuten darauf hin, dass dem Beitrag der endothelialen Barrierefunktion in Bezug auf eine Vielzahl von Speicheldrüsenerkrankungen genügend Aufmerksamkeit geschenkt werden muss.
Ein Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskop ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Dynamik von Zellen in intaktem Gewebe in vivo zu beobachten. Einer der Vorteile dieser Technik besteht darin, dass Nahinfrarotlicht (NIR) eine tiefere Gewebedurchdringung aufweist als sichtbares oder ultraviolettes Licht, wenn die Proben durch NIR angeregt werden, und unter geeigneten Bedingungen keine offensichtlichen Lichtschäden an Geweben verursacht 5,6. Tatsächlich sind die Speicheldrüsen ein sehr homogenes und oberflächliches Gewebe, in dem die oberflächlichen Azinuszellen nur etwa 30 μm von der Drüsenoberfläche entfernt sind 7,8. Es wurde gezeigt, dass die intravitale konfokale Mikroskopie die exokrine Sekretion und das Aktinzytoskelett in lebenden Mausspeicheldrüsen mit subzellulärer Auflösung untersuchen kann8. Die Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie hat jedoch nicht nur den Vorteil der konventionellen konfokalen Mikroskopie, sondern kann auch verwendet werden, um tieferes Gewebe und Bild klarer zu erkennen. Hier können fluoreszenzmarkierte Dextrans, die häufig als parazelluläre Permeabilitätstracerate eingesetzt werden und den Vorteil unterschiedlicher Größen haben, verwendet werden, um die Größe der TJ-Pore9 zu testen. In der vorliegenden Studie wird eine intravitale Echtzeit-Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie-Technik zur in situ Bewertung der endothelialen Barrierefunktion in Maus-SMGs etabliert. Jeder Arbeitsschritt zur in vivo vaskulären Permeabilitätsdetektion in Maus-SMGs ist im aktuellen Protokoll beschrieben. Hier ist ein Beispiel für die Detektion der endothelialen Barrierefunktion im SMG-Gangligationsmodell der Maus.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-photon microscope (TCS-SP8 DIVE)</td>
			<td>Leica, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 kDa FITC-labeled dextran</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>46944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 kDa rhodamine B-labeled dextran</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R9379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt tissue separation nickel</td>
			<td>Bejinghuabo Company</td>
			<td>NZW28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory cream</td>
			<td>Veet</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable sterile syringe</td>
			<td>Zhiyu Company</td>
			<td></td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>0253316</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline 1x</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G4207-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue scissors</td>
			<td>Bejinghuabo Company</td>
			<td>M286-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tribromoethanol</td>
			<td>JITIAN Bio</td>
			<td>JT0781</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo vascular permeability detection in mouse submandibular gland

Speichel spielt eine wichtige Rolle für die Mund- und allgemeine Gesundheit. Die intakte endotheliale Barrierefunktion der Blutgefäße ermöglicht die Speichelsekretion, während die Endothelbarriere-Dysfunktion mit vielen sekretorischen Speicheldrüsenstörungen zusammenhängt. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine in vivo parazelluläre Permeabilitätsnachweismethode zur Bewertung der Funktion von endothelialen Tight Junctions (TJs) in submandibulären Drüsen (SMG) der Maus. Zunächst wurden fluoreszenzmarkierte Dextrans mit unterschiedlichen Molekulargewichten (4 kDa, 40 kDa oder 70 kDa) in die eckigen Venen von Mäusen injiziert. Danach wurde das einseitige SMG seziert und in der kundenspezifischen Halterung unter einem Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskop fixiert, und dann wurden Bilder für Blutgefäße, Akini und Kanäle aufgenommen. Mit dieser Methode wurde die dynamische Echtzeit-Leckage der unterschiedlich großen Tracer von Blutgefäßen in die basalen Seiten der Acini und sogar über die Azinusepithelien in die Kanäle überwacht, um die Veränderung der endothelialen Barrierefunktion unter physiologischen oder pathophysiologischen Bedingungen zu bewerten.

Dem Protokoll folgend, wurde das einseitige SMG an einem speziell angefertigten Halter befestigt und die Drüse so weit wie möglich vom Mauskörper entfernt gehalten, um zu verhindern, dass die Atmung Bewegungsartefakte verursacht. Der schnelle Fluss der roten Blutkörperchen (schwarze Punkte) in Blutgefäßen wurde unter dem Mikroskop beobachtet. Nachdem man das Gewebefeld unter einer Augenlinse gefunden hat, muss man umschalten, um die Mikroskopsoftware zu manipulieren. In der Kontrollgruppe befanden sich beide Tracer...

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In Vivo Vascular Permeability Detection in Mouse Submandibular Gland

Im vorliegenden Protokoll wurde die endotheliale Barrierefunktion der submandibulären Drüse (SMG) durch Injektion verschiedener molekulargewichteter Fluoreszenztracer in die Winkelvenen von Versuchstiermodellen in vivo unter einem Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskop bewertet.

Im lebenden Organismus Nachweis der vaskulären Permeabilität in der submandibulären Drüse der Maus

Saliva plays an important role in oral and overall health. The intact endothelial barrier function of blood vessels enables saliva secretion, whereas the ...

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein in vivo parazelluläres Permeabilitätsnachweismaß zur Bewertung der Funktion enger endothelialer Verbindungen in submandibulären Drüsen der Maus. Die Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie hat jedoch nicht nur den Vorteil der konventionellen konfokalen Mikroskopie, sondern kann auch verwendet werden, um tieferes Gewebe zu erkennen und klarer abzubilden. Dieses Experiment bietet ein gutes methodisches Maß zur Beurteilung der vaskulären Permeabilität verschiedener Gewebe, insbesondere der Oberflächengewebe und Organe von Tieren.Beginnen Sie mit der Auswahl geeigneter Tracer wie Fluorescein, Isothiocyanat, markiertem Dextran und Rhodamin B, markiertem Dextran mit ausgeprägten Anregungsemissionsspektren, um die Interferenz zwischen Fluoreszenzsignalen für den Permeabilitätstest zu minimieren. Verdünnen Sie die Spuren zu steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung in 100 Milligramm pro Milliliter und lagern Sie die vor Licht geschützten Aliquots bei minus 20 Grad Celsius. Nach der Betäubung der 8 bis 10 Wochen alten männlichen Wildtyp-Maus halten Sie vorsichtig Kopf und Hals der Maus, damit eine Seite des Augapfels leicht hervorsteht.Führen Sie eine Insulinspritze mit 100 Mikrolitern fluoreszierender Tracerlösungsmischung entlang des Augenwinkels im rechten Winkel zum Auge ein. Nach der Injektion legen Sie die Maus schnell in Rückenlage mit Klebeband und geklebtem Kopf auf den Karton. Für die submandibuläre Drüse oder SMG-Isolierung schneiden Sie unter einem stereoskopischen Mikroskop die Epidermis des Halses mit einer allgemeinen Gewebeschere ab, um beide Seiten der SMGs freizulegen.Als nächstes verwenden Sie eine stumpfe Gewebetrennungsnadel, um die Kapsel sanft von der Drüsenoberfläche zu trennen, ohne das Drüsengewebe, die Blutgefäße und die Drüsenstruktur zu beschädigen. Schließen Sie die kundenspezifische Halterung an das Unterdruckgerät an und prüfen Sie im Vorfeld, ob die Unterdruckwirkung richtig erreicht wird. Legen Sie das freiliegende SMG vorsichtig auf den maßgeschneiderten Halter und saugen Sie das Gewebe durch Unterdruckabsaugen so weit wie möglich vom Mauskörper ab, um Bewegungsartefakte zu reduzieren, die durch Atmung und andere Bedingungen verursacht werden.Beginnen Sie mit der Bildgebung, kurz nachdem die Stelle der Drüse ausgewählt wurde. Erfassen Sie sequentielle Bilder entlang der Z-Achse, die zwei Mikrometer von der Oberfläche der Drüse entfernt sind, bis zu 70 bis 140 Mikrometer in das Gewebe, um eine dreidimensionale Konstruktion zu erzeugen. Als nächstes erfassen Sie eine Zeitrafferaufnahme der Gefäße, um die vaskuläre Permeabilität im SMG zu messen.Klicken Sie im Explorer-Dialog auf "Neuen Ordner hinzufügen" und ändern Sie den Dateinamen. Kehren Sie dann zur Spalte "Erfassung" zurück. In XY ist das Format 512 x 512 und die Geschwindigkeit beträgt 400 Hertz.Schalten Sie Bidirektional X" ein, stellen Sie den Zoomfaktor auf 0,75 und 1,5 für den Zoom ein. Als nächstes wählen Sie XYT unter "Aufnahmemodus", um Zeitrafferaufnahmen aufzunehmen. Stellen Sie die Dauer je nach experimentellem Bedarf auf 20 Sekunden, 30 Minuten oder länger ein.Nachdem Sie die Bedingungen eingestellt haben, klicken Sie auf "Live", um die vaskuläre Bildgebung von zwei Kanälen und überlappenden Kanälen im Fotoformungsrahmen zu beobachten und die Interessengebiete auszuwählen. Klicken Sie auf "Start", um die Bildgebung zu starten. In-vivo-Gefäßpermeabilitätstest und dreidimensionale Bilder von Blutgefäßen in Mäusen.Submandibuläre Drüsen sind hier dargestellt. In der Kontrollgruppe befanden sich beide Tracer in den Blutgefäßen der SMG. Aufgrund seines geringen Molekulargewichts konnte FD4 aus den Blutgefäßen zu den basalen Seiten von Acini und Kanälen austreten und so die Form der Acini und Gänge klar darstellen.Das RD70 wurde in großen Blutgefäßen und Mikrogefäßen verteilt. In der Duct-Ligationsgruppe wurden sowohl FD4 als auch RD70 auf die basalen Seiten von Acini extravasiert, was darauf hindeutet, dass die Duct-Ligatur die endotheliale Barrierefunktion stören und die Permeabilität für große Moleküle erhöhen könnte. Darüber hinaus bestätigten die semiquantitativen FD4- und RD70-Fluoreszenzintensitätsergebnisse diese Beobachtungen.Die dreidimensionalen Bilder zeigten eine viel verdecktere Fluoreszenz von FD4 und RD70 um Blutgefäße in der Ligationsgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe. Eine sorgfältige SMG-Isolierung und geeignete Platzierung sowie das Mikroskop sind wesentliche Voraussetzungen für eine erfolgreiche Detektion. Nach den Verfahren kann die Blutflussrate berechnet werden, indem die Bewegung der roten Blutkörperchen geheiratet und die Infiltration der fluoreszenzmarkierten Blutzellen verfolgt werden kann.

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Vascular Permeability Detection in Mouse Submandibular Gland

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Einzel-Zell-Saug-Recordings aus Maus Zapfen-Photorezeptoren

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

Forschung

Biologie

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In-vivo-Imaging und therapeutische Behandlungen in einem orthotopen Mausmodell des Eierstockkrebs

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

Evaluation der Brustdrüse Entwicklung und Funktion in Mausmodellen

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

Multi-Parameter-Messung der Durchlässigkeit Transition Pore Opening in isolierten Maus-Mitochondrien

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

Intraduktale Injection für Lokalisierte Drug Delivery auf die Maus Milchdrüse

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Messung des osmotischen Wasserdurchlässigkeit Koeffizient (P<sub&gt; F</sub&gt;) Von sphärischen Zellen: Isolierte Pflanzenprotoplasten als Beispiel

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Messung der Steifigkeit von<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Maus Aorten Mit Rasterkraftmikroskopie

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

Die Maus isoliert perfundierten Nieren-Technik

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

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In Vivo Detektion und Analyse von Rb Protein Sumoylierung in menschlichen Zellen

The post-translational modifications of proteins are critical for the proper regulation of intracellular signal transduction. Among these modifications, ...