Name: in vivo vascular permeability detection in mouse submandibular gland
Uploaded: 2022-08-04T14:00:00
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Questo studio è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (sovvenzioni 31972908, 81991500, 81991502, 81771093 e 81974151) e dalla Beijing Natural Science Foundation (grant 7202082).

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal Comitato etico per la ricerca sugli animali, Centro di scienze della salute dell'Università di Pechino, e sono conformi alla Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (pubblicazione NIH n. 85-23, rivista nel 1996). Per il presente studio sono stati utilizzati topi maschi wild-type (WT) nella fascia di età di 8-10 settimane. Gli animali da esperimento sono stati trattati con cura per ridurre al minimo il loro dolore e disagio.
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Il mantenimento e la regolazione della funzione della barriera endoteliale sono essenziali per l'omeostasi vascolare. Le cellule endoteliali e le loro giunzioni intercellulari svolgono un ruolo critico nel mantenimento e nel controllo dell'integrità vascolare12. La forza di taglio del flusso sanguigno, i fattori di crescita e i fattori infiammatori possono causare cambiamenti nella permeabilità vascolare e, quindi, partecipare all'insorgenza e allo sviluppo di malattie sistemiche come ipertensio...

Varie ghiandole salivari producono saliva, che agisce principalmente come prima linea di difesa contro le infezioni e aiuta la digestione, svolgendo così un ruolo essenziale nella salute orale e generale1. L'afflusso di sangue è fondamentale per la secrezione delle ghiandole salivari poiché fornisce costantemente acqua, elettroliti e molecole che formano la saliva primaria. La funzione di barriera endoteliale, regolata dal complesso a giunzione stretta (TJ), limita rigorosamente e delicatamente la permeazione dei capillari, che sono altamente permeabili all'acqua, ai soluti, alle proteine e persino alle cellule che si spostano dai vasi sanguigni circolanti nei tessuti delle ghiandole salivari 2,3. Abbiamo precedentemente scoperto che l'apertura dei TJ endoteliali in risposta a uno stimolo colinergico facilita la secrezione di saliva, mentre la compromissione della funzione della barriera endoteliale è interconnessa con l'iposecrezione e l'infiltrazione linfocitaria nelle ghiandole sottomandibolari (SMG) nella sindrome di Sjögren4. Questi dati suggeriscono che il contributo della funzione di barriera endoteliale deve essere prestato sufficiente attenzione per quanto riguarda una varietà di malattie delle ghiandole salivari.
Un microscopio a scansione laser a due fotoni è un potente strumento per osservare la dinamica delle cellule nei tessuti intatti in vivo. Uno dei vantaggi di questa tecnica è che la luce nel vicino infrarosso (NIR) ha una penetrazione tissutale più profonda rispetto alla luce visibile o ultravioletta quando i campioni sono eccitati dalla NIR e non causa evidenti danni alla luce ai tessuti in condizioni appropriate 5,6. Infatti, le ghiandole salivari sono un tessuto molto omogeneo e superficiale, in cui le cellule acinose superficiali distano solo circa 30 μm dalla superficie della ghiandola 7,8. È stato dimostrato che la microscopia confocale intravitale può studiare la secrezione esocrina e il citoscheletro di actina nelle ghiandole salivari di topo vivo a risoluzione subcellulare8. La microscopia a scansione laser a due fotoni, tuttavia, non solo ha il vantaggio della microscopia confocale convenzionale, ma può anche essere utilizzata per rilevare più chiaramente tessuti e immagini più profondi. Qui, i destrani marcati con fluorescenza, che sono spesso usati come traccianti di permeabilità paracellulare e hanno il vantaggio di diverse dimensioni, possono essere utilizzati per testare la grandezza del poro TJ9. Nel presente studio, viene stabilita una tecnica di microscopia laser a scansione laser a due fotoni intravitale in tempo reale per la valutazione in situ della funzione della barriera endoteliale negli SMG di topo. Ogni fase di lavoro per il rilevamento della permeabilità vascolare in vivo nelle SMG di topo è descritta nel protocollo corrente. Ecco un esempio di rilevamento della funzione della barriera endoteliale nel modello di legatura del dotto SMG del topo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-photon microscope (TCS-SP8 DIVE)</td>
			<td>Leica, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 kDa FITC-labeled dextran</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>46944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 kDa rhodamine B-labeled dextran</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R9379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt tissue separation nickel</td>
			<td>Bejinghuabo Company</td>
			<td>NZW28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory cream</td>
			<td>Veet</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable sterile syringe</td>
			<td>Zhiyu Company</td>
			<td></td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>0253316</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline 1x</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G4207-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue scissors</td>
			<td>Bejinghuabo Company</td>
			<td>M286-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tribromoethanol</td>
			<td>JITIAN Bio</td>
			<td>JT0781</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo vascular permeability detection in mouse submandibular gland

La saliva svolge un ruolo importante nella salute orale e generale. La funzione di barriera endoteliale intatta dei vasi sanguigni consente la secrezione di saliva, mentre la disfunzione della barriera endoteliale è correlata a molti disturbi secretori delle ghiandole salivari. Il presente protocollo descrive un metodo di rilevamento della permeabilità paracellulare in vivo per valutare la funzione delle giunzioni strette endoteliali (TJ) nelle ghiandole sottomandibolari di topo (SMG). In primo luogo, dextrans marcati con fluorescenza con diversi pesi molecolari (4 kDa, 40 kDa o 70 kDa) sono stati iniettati nelle vene angolari dei topi. Successivamente, l'SMG unilaterale è stato sezionato e fissato nel supporto personalizzato sotto un microscopio a scansione laser a due fotoni, quindi sono state catturate immagini per vasi sanguigni, acini e condotti. Utilizzando questo metodo, è stata monitorata la perdita dinamica in tempo reale dei traccianti di diverse dimensioni dai vasi sanguigni nei lati basali degli acini e persino attraverso gli epiteli acinosi nei dotti per valutare l'alterazione della funzione della barriera endoteliale in condizioni fisiologiche o fisiopatologiche.

Seguendo il protocollo, l'SMG unilaterale è stato collegato a un supporto su misura e la ghiandola è stata tenuta il più lontano possibile dal corpo del topo per evitare che la respirazione causasse artefatti di movimento. Il rapido flusso dei globuli rossi (punti neri) nei vasi sanguigni è stato osservato al microscopio. Dopo aver trovato il campo di tessuto sotto una lente oculare, si deve passare a manipolare il software del microscopio. Nel gruppo di controllo, entrambi i traccianti esistevano nei vasi sanguigni ...

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In Vivo Vascular Permeability Detection in Mouse Submandibular Gland

Nel presente protocollo, la funzione di barriera endoteliale della ghiandola sottomandibolare (SMG) è stata valutata iniettando diversi traccianti fluorescenti pesati molecolari nelle vene angolari di modelli animali in vivo sotto un microscopio a scansione laser a due fotoni.

In vivo Rilevamento della permeabilità vascolare nella ghiandola sottomandibolare del topo

Saliva plays an important role in oral and overall health. The intact endothelial barrier function of blood vessels enables saliva secretion, whereas the ...

Il presente protocollo descrive una misura di rilevamento della permeabilità paracellulare in vivo per valutare la funzione delle giunzioni endoteliali strette nelle ghiandole sottomandibolari di topo. La microscopia a scansione laser a due fotoni, tuttavia, non solo ha il vantaggio della microscopia confocale convenzionale, ma può anche essere utilizzata per rilevare più chiaramente tessuti e immagini più profondi. Questo esperimento fornisce un buon metodo di misura per valutare la permeabilità vascolare di diversi tessuti, in particolare i tessuti superficiali e gli organi degli animali.Inizia scegliendo traccianti appropriati come fluoresceina, isotiocianato, destrano marcato e Rhodamine B, destrano marcato con spettri di emissione di eccitazione distinti, per ridurre al minimo l'interferenza tra i segnali di fluorescenza per il saggio di permeabilità. Diluire le tracce in soluzione salina tamponata con fosfato sterile in 100 milligrammi per millilitro di scorte e conservare le aliquote al riparo dalla luce a meno 20 gradi Celsius. Dopo aver anestetizzato il topo selvatico maschio di 8-10 settimane, tenere delicatamente la testa e il collo del topo per far sporgere leggermente un lato del bulbo oculare.Inserire una siringa da insulina contenente 100 microlitri di miscela di soluzione tracciante fluorescente lungo l'angolo dell'occhio ad angolo retto rispetto all'occhio. Dopo l'iniezione, posizionare rapidamente il mouse sul cartone in posizione supina con gli arti e la testa nastrati. Per l'isolamento della ghiandola sottomandibolare o SMG, al microscopio stereoscopico, tagliare l'epidermide del collo con forbici tissutali generali per esporre entrambi i lati delle SMG.Quindi, utilizzare un ago per la separazione del tessuto smussato per separare delicatamente la capsula dalla superficie della ghiandola senza danneggiare il tessuto ghiandolare, i vasi sanguigni e la struttura ghiandolare. Collegare il supporto personalizzato al dispositivo a pressione negativa e verificare in anticipo se l'effetto della pressione negativa è stato raggiunto correttamente. Posizionare delicatamente l'SMG esposto sul supporto personalizzato e aspirare il tessuto mediante aspirazione a pressione negativa, il più lontano possibile dal corpo del topo, per ridurre gli artefatti di movimento causati dalla respirazione e da altre condizioni.Iniziare l'imaging subito dopo aver scelto il sito della ghiandola. Acquisire immagini sequenziali lungo l'asse Z a due micron di distanza dalla superficie della ghiandola fino a 70-140 micron nel tessuto per generare una costruzione tridimensionale. Successivamente, acquisire l'imaging time-lapse dei vasi per misurare la permeabilità vascolare nella SMG.Nella finestra di dialogo Explorer, fare clic su Aggiungi nuova cartella" e modificare il nome del file. Quindi, torna alla colonna di acquisizione. In XY, il formato è 512 per 512 e la velocità è 400 hertz.Attivare "X" bidirezionale, impostare il fattore di zoom su 0,75 e 1,5 per lo zoom. Quindi, selezionare XYT in Modalità di acquisizione "per acquisire l'imaging time lapse. Impostare la durata su 20 secondi, 30 minuti o più a seconda delle esigenze sperimentali.Dopo aver impostato le condizioni, fare clic su "Live" per osservare l'imaging vascolare di due canali e canali sovrapposti nella cornice di formazione della foto e scegliere le aree di interesse. Fare clic su Start" per iniziare l'imaging. Saggio di permeabilità vascolare in vivo e immagini tridimensionali dei vasi sanguigni nei topi.Le ghiandole sottomandibolari sono mostrate qui. Nel gruppo di controllo, entrambi i traccianti esistevano nei vasi sanguigni dell'SMG. A causa del suo piccolo peso molecolare, FD4 è stato in grado di fuoriuscire dai vasi sanguigni ai lati basali di acini e condotti, raffigurando così chiaramente la forma degli acini e dei condotti.L'RD70 è stato distribuito in vasi sanguigni e microvasi di grandi dimensioni. Nel gruppo di legatura del dotto, sia FD4 che RD70 sono stati stravasati ai lati basali degli acini, il che ha indicato che la legatura del dotto potrebbe interrompere la funzione di barriera endoteliale e aumentare la permeabilità alle grandi molecole. Inoltre, i risultati semi-quantitativi dell'intensità di fluorescenza FD4 e RD70 hanno confermato queste osservazioni.Le immagini tridimensionali hanno mostrato una fluorescenza molto più oscurata di FD4 e RD70 intorno ai vasi sanguigni nel gruppo di legatura rispetto al gruppo di controllo. Un attento isolamento SMG e un posizionamento appropriato e il microscopio sono prerequisiti essenziali per una rilevazione di successo. Seguendo le procedure, la portata sanguigna può essere calcolata sposando il movimento dei globuli rossi e l'infiltrazione delle cellule del sangue marcate con fluorescenza può essere inseguita.

Research

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