Name: in vivo vascular permeability detection in mouse submandibular gland
Uploaded: 2022-08-04T14:00:00
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Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (bolsas 31972908, 81991500, 81991502, 81771093 e 81974151) e pela Fundação de Ciências Naturais de Pequim (7202082 de subsídios).

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal do Centro de Ciências da Saúde da Universidade de Pequim e cumpriram o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (NIH Publication No. 85-23, revisado em 1996). Camundongos machos do tipo selvagem (WT) na faixa etária de 8-10 semanas foram utilizados para o presente estudo. Os animais experimentais foram cuidadosamente tratados para minimizar sua dor e desconforto.
1. Procedimentos...

<ol>
	<li>Carpenter, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secretion,+components,+and+properties+of+saliva.">The secretion, components, and properties of saliva.</a> Annual Review of Food Science and Technology. 4, 267-276 (2013).</li><li>Garrett, J. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+magic:+Multiphoton+microscopy+in+the+biosciences.">Nonlinear magic: Multiphoton microscopy in the biosciences.</a> Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).</li><li>Masedunskas, A., Sramkova, M., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostasis+of+the+apical+plasma+membrane+during+regulated+exocytosis+in+the+salivary+glands+of+live+rodents.">Homeostasis of the apical plasma membrane during regulated exocytosis in the salivary glands of live rodents.</a> Bioarchitecture. 1 (5), 225-229 (2011).</li><li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+the+actomyosin+complex+in+regulated+exocytosis+revealed+by+intravital+microscopy.">Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13552-13557 (2011).</li><li>Balda, M. 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A manutenção e regulação da função de barreira endotelial são essenciais para a homeostase vascular. As células endoteliais e suas junções intercelulares desempenham um papel crítico na manutenção e controle da integridade vascular12. A força de cisalhamento do fluxo sanguíneo, fatores de crescimento e fatores inflamatórios podem causar alterações na permeabilidade vascular e, assim, participar da ocorrência e desenvolvimento de doenças sistêmicas como hipertensão, diabetes e...

Várias glândulas salivares produzem saliva, que atua principalmente como a primeira linha de defesa contra infecções e ajuda a digestão, desempenhando assim um papel essencial na saúde bucal e geral1. O suprimento de sangue é crucial para a secreção das glândulas salivares, uma vez que fornece constantemente água, eletrólitos e moléculas que formam a saliva primária. A função de barreira endotelial, regulada pelo complexo de junção apertada (TJ), limita estrita e delicadamente a permeação dos capilares, que são altamente permeáveis à água, solutos, proteínas e até mesmo células que se deslocam dos vasos sanguíneos circulantes para os tecidos das glândulas salivares 2,3. Descobrimos anteriormente que a abertura dos TJs endoteliais em resposta a um estímulo colinérgico facilita a secreção salivar, enquanto o comprometimento da função da barreira endotelial está interligado com hipossecreção e infiltração linfocítica nas glândulas submandibulares (SMGs) na síndrome de Sjögren4. Esses dados sugerem que a contribuição da função de barreira endotelial precisa ser prestada atenção suficiente em relação a uma variedade de doenças das glândulas salivares.
Um microscópio de varredura a laser de dois fótons é uma ferramenta poderosa para observar a dinâmica das células no tecido intacto in vivo. Uma das vantagens dessa técnica é que a luz infravermelha próxima (NIR) tem penetração tecidual mais profunda do que a luz visível ou ultravioleta quando os espécimes são excitados pelo NIR e não causa danos evidentes à luz dos tecidos sob condições apropriadas 5,6. De fato, as glândulas salivares são um tecido muito homogêneo e superficial, no qual as células acinares superficiais estão a apenas cerca de 30 μm de distância da superfície da glândula 7,8. Demonstrou-se que a microscopia confocal intravital pode estudar a secreção exócrina e o citoesqueleto de actina em glândulas salivares vivas de camundongos em resolução subcelular8. A microscopia de varredura a laser de dois fótons, no entanto, não só tem a vantagem da microscopia confocal convencional, mas também pode ser usada para detectar tecidos e imagens mais profundos com mais clareza. Aqui, o dextrans marcado por fluorescência, que é frequentemente usado como traçador de permeabilidade paracelular e tem a vantagem de diferentes tamanhos, pode ser usado para testar a magnitude do poro TJ9. No presente estudo, uma técnica intravital de microscopia a laser de dois fótons em tempo real é estabelecida para avaliação in situ da função da barreira endotelial em SMGs de camundongos. Cada etapa de trabalho para detecção de permeabilidade vascular in vivo em SMGs de camundongos é descrita no protocolo atual. Aqui está um exemplo de detecção da função de barreira endotelial no modelo de ligadura do ducto SMG do rato.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-photon microscope (TCS-SP8 DIVE)</td>
			<td>Leica, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 kDa FITC-labeled dextran</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>46944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 kDa rhodamine B-labeled dextran</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R9379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt tissue separation nickel</td>
			<td>Bejinghuabo Company</td>
			<td>NZW28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory cream</td>
			<td>Veet</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable sterile syringe</td>
			<td>Zhiyu Company</td>
			<td></td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>0253316</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline 1x</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G4207-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue scissors</td>
			<td>Bejinghuabo Company</td>
			<td>M286-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tribromoethanol</td>
			<td>JITIAN Bio</td>
			<td>JT0781</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo vascular permeability detection in mouse submandibular gland

A saliva desempenha um papel importante na saúde oral e geral. A função de barreira endotelial intacta dos vasos sanguíneos permite a secreção de saliva, enquanto a disfunção da barreira endotelial está relacionada a muitos distúrbios secretores das glândulas salivares. O presente protocolo descreve um método de detecção de permeabilidade paracelular in vivo para avaliar a função das junções endoteliais apertadas (TJs) em glândulas submandibulares de camundongos (SMG). Primeiro, dextrans marcado com fluorescência com diferentes pesos moleculares (4 kDa, 40 kDa, ou 70 kDa) foram injetados nas veias angulares de camundongos. Posteriormente, o SMG unilateral foi dissecado e fixado no suporte personalizado sob um microscópio de varredura a laser de dois fótons e, em seguida, as imagens foram capturadas para vasos sanguíneos, ácinos e dutos. Utilizando este método, o vazamento dinâmico em tempo real dos traçadores de diferentes tamanhos dos vasos sanguíneos para os lados basais dos ácinos e até mesmo através do epitélio acinar para os ductos foi monitorado para avaliar a alteração da função de barreira endotelial sob condições fisiológicas ou fisiopatológicas.

Seguindo o protocolo, o SMG unilateral foi anexado a um suporte personalizado, e a glândula foi mantida o mais longe possível do corpo do rato para evitar que a respiração causasse artefatos de movimento. O rápido fluxo dos glóbulos vermelhos (pontos pretos) nos vasos sanguíneos foi observado ao microscópio. Depois de encontrar o campo de tecido sob uma lente ocular, deve-se mudar para manipular o software do microscópio. No grupo controle, ambos os marcadores existiam nos vasos sanguíneos do camundongo SMG. Em...

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In Vivo Vascular Permeability Detection in Mouse Submandibular Gland

No presente protocolo, a função de barreira endotelial da glândula submandibular (SMG) foi avaliada por meio da injeção de diferentes marcadores fluorescentes de peso molecular nas veias angulares de modelos animais de teste in vivo sob um microscópio de varredura a laser de dois fótons.

In vivo Detecção de Permeabilidade Vascular em Glândula Submandibular de Camundongo

Saliva plays an important role in oral and overall health. The intact endothelial barrier function of blood vessels enables saliva secretion, whereas the ...

O presente protocolo descreve uma medida de detecção de permeabilidade paracelular in vivo para avaliar a função de junções endoteliais apertadas em glândulas submandibulares de camundongos. A microscopia de varredura a laser de dois fótons, no entanto, não só tem a vantagem da microscopia confocal convencional, mas também pode ser usada para detectar tecidos e imagens mais profundos com mais clareza. Este experimento fornece uma boa medida de método para avaliar a permeabilidade vascular de diferentes tecidos, especialmente os tecidos superficiais e órgãos de animais.Comece escolhendo marcadores apropriados, como fluoresceína, isotiocianato, dextrano marcado e rodamina B, dextran marcado com espectros distintos de emissões de excitação, para minimizar a interferência entre os sinais de fluorescência para o ensaio de permeabilidade. Diluir os vestígios em solução salina tamponada com fosfato estéril em estoques de 100 miligramas por mililitro e armazenar as alíquotas protegidas da luz a menos 20 graus Celsius. Depois de anestesiar o rato macho do tipo selvagem de 8 a 10 semanas de idade, segure suavemente a cabeça e o pescoço do rato para fazer com que um lado do globo ocular se projete ligeiramente.Insira uma seringa de insulina contendo 100 microlitros de mistura de solução de marcador fluorescente ao longo do canto do olho em ângulo reto com o olho. Após a injeção, coloque rapidamente o rato sobre o cartão em decúbito dorsal com os membros e a cabeça adesivados. Para isolamento da glândula submandibular ou SMG, sob um microscópio estereoscópico, corte a epiderme do pescoço com tesouras de tecido geral para expor ambos os lados dos SMGs.Em seguida, use uma agulha de separação de tecido contundente para separar suavemente a cápsula da superfície da glândula sem danificar o tecido da glândula, os vasos sanguíneos e a estrutura glandular. Conecte o suporte personalizado ao dispositivo de pressão negativa e verifique se o efeito de pressão negativa é adequadamente alcançado com antecedência. Coloque suavemente o SMG exposto no suporte personalizado e sugue o tecido por sucção por pressão negativa, o mais longe possível do corpo do rato, para reduzir os artefactos de movimento causados pela respiração e outras condições.Comece a imagem logo após o local da glândula ser escolhido. Adquira imagens sequenciais ao longo do eixo Z a dois mícrons de distância da superfície da glândula até 70 a 140 mícrons no tecido para gerar uma construção tridimensional. Em seguida, adquira imagens de lapso de tempo dos vasos para medir a permeabilidade vascular no SMG.Na caixa de diálogo Explorer, clique em Adicionar Nova Pasta" e altere o nome do arquivo. Em seguida, volte para a coluna de aquisição. Em XY, o formato é de 512 por 512, e a velocidade é de 400 hertz.Ative o X"R bidirecional, defina o fator de zoom como 0,75 e 1,5 para zoom. Em seguida, selecione XYT em Modo de Aquisição "para adquirir imagens de lapso de tempo. Defina a duração para 20 segundos, 30 minutos ou mais, de acordo com a necessidade experimental.Depois de definir as condições, clique em Live"para observar a imagem vascular de dois canais e canais sobrepostos no quadro de formação de fotos e escolha as áreas de interesse. Clique em Iniciar" para iniciar a geração de imagens. Ensaio de permeabilidade vascular in vivo e imagens tridimensionais de vasos sanguíneos em camundongos.As glândulas submandibulares são mostradas aqui. No grupo controle, ambos os marcadores existiam nos vasos sanguíneos do SMG. Devido ao seu pequeno peso molecular, o FD4 foi capaz de vazar dos vasos sanguíneos para os lados basais dos ácinos e ductos, descrevendo assim claramente a forma dos ácinos e ductos.O RD70 foi distribuído em vasos sanguíneos de grande porte e microvasos. No grupo ligadura do ducto, tanto o FD4 quanto o RD70 foram extravasados para os lados basais dos ácinos, o que indicou que a ligadura do ducto poderia interromper a função de barreira endotelial e aumentar a permeabilidade a moléculas grandes. Além disso, os resultados semiquantitativos de intensidade de fluorescência FD4 e RD70 confirmaram essas observações.As imagens tridimensionais mostraram fluorescência muito mais obscurecida de FD4 e RD70 ao redor dos vasos sanguíneos no grupo ligadura em comparação com o grupo controle. O isolamento cuidadoso do SMG e a colocação apropriada e o microscópio são pré-requisitos essenciais para uma detecção bem-sucedida. Após os procedimentos, a taxa de fluxo sanguíneo pode ser calculada casando o movimento dos glóbulos vermelhos e a infiltração das células sanguíneas marcadas com fluorescência pode ser perseguida.

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Vascular Permeability Detection in Mouse Submandibular Gland

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Biologia

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Parâmetro Multi-Medição da abertura dos poros transição de permeabilidade em mitocôndrias isoladas de coração Rato

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Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

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