Name: in vivo vascular permeability detection in mouse submandibular gland
Uploaded: 2022-08-04T14:00:00
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Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvenciones 31972908, 81991500, 81991502, 81771093 y 81974151) y la Fundación de Ciencias Naturales de Beijing (subvención 7202082).

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de Ética de Investigación Animal, Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Pekín, y cumplieron con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Publicación NIH No. 85-23, revisada en 1996). Para el presente estudio se utilizaron ratones machos de tipo salvaje (WT) en el grupo de edad de 8-10 semanas. Los animales experimentales fueron tratados cuidadosamente para minimizar su dolor y malestar.
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El mantenimiento y la regulación de la función de barrera endotelial son esenciales para la homeostasis vascular. Las células endoteliales y sus uniones intercelulares juegan un papel crítico en el mantenimiento y control de la integridad vascular12. La fuerza de corte del flujo sanguíneo, los factores de crecimiento y los factores inflamatorios pueden causar cambios en la permeabilidad vascular y, por lo tanto, participar en la ocurrencia y desarrollo de enfermedades sistémicas como hiperte...

Varias glándulas salivales producen saliva, que actúa principalmente como la primera línea de defensa contra las infecciones y ayuda a la digestión, desempeñando así un papel esencial en la salud oral y general1. El suministro de sangre es crucial para la secreción de las glándulas salivales, ya que proporciona constantemente agua, electrolitos y moléculas que forman la saliva primaria. La función de barrera endotelial, regulada por el complejo de unión estrecha (TJ), limita estricta y delicadamente la permeación de los capilares, que son altamente permeables al agua, solutos, proteínas e incluso células que se mueven desde los vasos sanguíneos circulantes hacia los tejidos de las glándulas salivales 2,3. Hemos encontrado previamente que la apertura de los TJ endoteliales en respuesta a un estímulo colinérgico facilita la secreción de saliva, mientras que el deterioro de la función de barrera endotelial está interrelacionado con la hiposecreción y la infiltración linfocítica en las glándulas submandibulares (SMG) en el síndrome de Sjögren4. Estos datos sugieren que la contribución de la función de barrera endotelial debe prestarse suficiente atención con respecto a una variedad de enfermedades de las glándulas salivales.
Un microscopio de escaneo láser de dos fotones es una herramienta poderosa para observar la dinámica de las células en el tejido intacto in vivo. Una de las ventajas de esta técnica es que la luz infrarroja cercana (NIR) tiene una penetración tisular más profunda que la luz visible o ultravioleta cuando las muestras son excitadas por NIR y no causa daño obvio a los tejidos en condiciones apropiadas 5,6. De hecho, las glándulas salivales son un tejido muy homogéneo y superficial, en el que las células acinares superficiales están a sólo unos 30 μm de distancia de la superficie de la glándula 7,8. Se ha demostrado que la microscopía confocal intravital puede estudiar la secreción exocrina y el citoesqueleto de actina en glándulas salivales de ratón vivas a resolución subcelular8. Sin embargo, la microscopía de barrido láser de dos fotones no solo tiene la ventaja de la microscopía confocal convencional, sino que también se puede usar para detectar tejidos e imágenes más profundos con mayor claridad. Aquí, los dextranos marcados con fluorescencia, que se utilizan con frecuencia como trazadores de permeabilidad paracelular y tienen la ventaja de diferentes tamaños, se pueden usar para probar la magnitud del poro TJ9. En el presente estudio, se establece una técnica intravital de microscopía de barrido láser de dos fotones en tiempo real para la evaluación in situ de la función de barrera endotelial en SMG de ratón. Cada paso de trabajo para la detección de permeabilidad vascular in vivo en SMG de ratón se describe en el protocolo actual. Aquí hay un ejemplo de detección de la función de barrera endotelial en el modelo de ligadura del conducto SMG del ratón.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-photon microscope (TCS-SP8 DIVE)</td>
			<td>Leica, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 kDa FITC-labeled dextran</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>46944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 kDa rhodamine B-labeled dextran</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R9379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt tissue separation nickel</td>
			<td>Bejinghuabo Company</td>
			<td>NZW28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory cream</td>
			<td>Veet</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable sterile syringe</td>
			<td>Zhiyu Company</td>
			<td></td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>0253316</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline 1x</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G4207-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue scissors</td>
			<td>Bejinghuabo Company</td>
			<td>M286-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tribromoethanol</td>
			<td>JITIAN Bio</td>
			<td>JT0781</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo vascular permeability detection in mouse submandibular gland

La saliva juega un papel importante en la salud oral y general. La función de barrera endotelial intacta de los vasos sanguíneos permite la secreción de saliva, mientras que la disfunción de la barrera endotelial está relacionada con muchos trastornos secretores de las glándulas salivales. El presente protocolo describe un método de detección de permeabilidad paracelular in vivo para evaluar la función de las uniones estrechas endoteliales (TJ) en glándulas submandibulares de ratón (SMG). Primero, se inyectaron dextranos marcados con fluorescencia con diferentes pesos moleculares (4 kDa, 40 kDa o 70 kDa) en las venas angulares de ratones. Posteriormente, el SMG unilateral se diseccionó y fijó en el soporte personalizado bajo un microscopio de escaneo láser de dos fotones, y luego se capturaron imágenes de vasos sanguíneos, acinos y conductos. Utilizando este método, se monitorizó la fuga dinámica en tiempo real de los trazadores de diferentes tamaños de los vasos sanguíneos hacia los lados basales de los acinos e incluso a través del epitelio acinar hacia los conductos para evaluar la alteración de la función de barrera endotelial en condiciones fisiológicas o fisiopatológicas.

Siguiendo el protocolo, el SMG unilateral se unió a un soporte hecho a medida, y la glándula se mantuvo lo más lejos posible del cuerpo del ratón para evitar que la respiración causara artefactos de movimiento. El flujo rápido de los glóbulos rojos (puntos negros) en los vasos sanguíneos se observó bajo el microscopio. Después de encontrar el campo de tejido debajo de una lente ocular, uno debe cambiar para manipular el software del microscopio. En el grupo de control, ambos trazadores existían en los vasos sa...

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In Vivo Vascular Permeability Detection in Mouse Submandibular Gland

En el presente protocolo, la función de barrera endotelial de la glándula submandibular (SMG) se evaluó inyectando diferentes trazadores fluorescentes ponderados molecularmente en las venas angulares de modelos animales de prueba in vivo bajo un microscopio de escaneo láser de dos fotones.

In vivo Detección de permeabilidad vascular en glándula submandibular de ratón

Saliva plays an important role in oral and overall health. The intact endothelial barrier function of blood vessels enables saliva secretion, whereas the ...

El presente protocolo describe una medida de detección de permeabilidad paracelular in vivo para evaluar la función de las uniones endoteliales estrechas en glándulas submandibulares de ratón. Sin embargo, la microscopía de barrido láser de dos fotones no solo tiene la ventaja de la microscopía confocal convencional, sino que también se puede usar para detectar tejidos e imágenes más profundos con mayor claridad. Este experimento proporciona una buena medida de método para evaluar la permeabilidad vascular de diferentes tejidos, especialmente los tejidos superficiales y órganos de los animales.Comience eligiendo trazadores apropiados como fluoresceína, isotiocianato, dextrano marcado y rodamina B, marcado como dextrano con espectros de emisiones de excitación distintos, para minimizar la interferencia entre las señales de fluorescencia para el ensayo de permeabilidad. Diluir las trazas en solución salina tamponada con fosfato estéril en 100 miligramos por mililitro y almacenar las alícuotas protegidas de la luz a menos 20 grados centígrados. Después de anestesiar al ratón macho de tipo salvaje de 8 a 10 semanas de edad, sostenga suavemente la cabeza y el cuello del ratón para hacer que un lado del globo ocular sobresalga ligeramente.Inserte una jeringa de insulina que contenga 100 microlitros de mezcla de solución trazadora fluorescente a lo largo de la esquina del ojo en ángulo recto con el ojo. Después de la inyección, coloque rápidamente el ratón sobre el cartón en posición supina con las extremidades y la cabeza pegadas con cinta adhesiva. Para el aislamiento de la glándula submandibular o SMG, bajo un microscopio estereoscópico, corte la epidermis del cuello con tijeras de tejido general para exponer ambos lados de los SMG.Luego, use una aguja de separación de tejido romo para separar suavemente la cápsula de la superficie de la glándula sin dañar el tejido glandular, los vasos sanguíneos y la estructura glandular. Conecte el soporte personalizado al dispositivo de presión negativa y verifique si el efecto de presión negativa se logra correctamente de antemano. Coloque suavemente el SMG expuesto en el soporte personalizado y aspire el tejido mediante succión de presión negativa, lo más lejos posible del cuerpo del ratón, para reducir los artefactos de movimiento causados por la respiración y otras afecciones.Comience a tomar imágenes poco después de que se elija el sitio de la glándula. Adquiera imágenes secuenciales a lo largo del eje Z escalonadas dos micras de distancia de la superficie de la glándula hasta 70 a 140 micras en el tejido para generar una construcción tridimensional. A continuación, adquiera imágenes de lapso de tiempo de los vasos para medir la permeabilidad vascular en el SMG.En el cuadro de diálogo del Explorador, haga clic en Agregar nueva carpeta" y cambie el nombre del archivo. A continuación, vuelva a la columna de adquisición. En XY, el formato es de 512 por 512, y la velocidad es de 400 hercios.Active la X bidireccional, establezca el factor de zoom en 0,75 y 1,5 para el zoom. A continuación, seleccione XYT en Modo de adquisición" para adquirir imágenes de lapso de tiempo. Establezca la duración en 20 segundos, 30 minutos o más según la necesidad experimental.Después de establecer las condiciones, haga clic en "En vivo" para observar la imagen vascular de dos canales y canales superpuestos en el marco de formación de fotos y elegir las áreas de interés. Haga clic en Inicio" para comenzar la creación de imágenes. Ensayo de permeabilidad vascular in vivo e imágenes tridimensionales de vasos sanguíneos en ratones.Las glándulas submandibulares se muestran aquí. En el grupo control, ambos marcadores existían en los vasos sanguíneos del SMG. Debido a su pequeño peso molecular, FD4 fue capaz de filtrarse de los vasos sanguíneos a los lados basales de acinos y conductos, representando así claramente la forma de los acinos y conductos.El RD70 se distribuyó en vasos sanguíneos de gran tamaño y microvasos. En el grupo de ligadura de conductos, tanto FD4 como RD70 se extravasaron a los lados basales de los acinos, lo que indicó que la ligadura del conducto podría interrumpir la función de barrera endotelial y aumentar la permeabilidad a moléculas grandes. Además, los resultados semicuantitativos de intensidad de fluorescencia FD4 y RD70 confirmaron estas observaciones.Las imágenes tridimensionales mostraron una fluorescencia mucho más oscura de FD4 y RD70 alrededor de los vasos sanguíneos en el grupo de ligadura en comparación con el grupo de control. El aislamiento cuidadoso de SMG y la colocación adecuada y el microscopio son requisitos previos esenciales para una detección exitosa. Después de los procedimientos, la tasa de flujo sanguíneo se puede calcular combinando el movimiento de los glóbulos rojos y se puede perseguir la infiltración de las células sanguíneas marcadas con fluorescencia.

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Vascular Permeability Detection in Mouse Submandibular Gland

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Inyección intraductal de entrega de la droga localizada a la glándula mamaria de ratón

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Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

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Medición de la osmótica de agua Coeficiente de Permeabilidad (P<sub&gt; F</sub&gt;) De células esféricas: protoplastos de plantas aisladas como ejemplo

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