2.9K Views
•
13:01 min
•
June 3rd, 2022
DOI :
June 3rd, 2022
•0:04
Introduction
1:07
LMD Slide(s) Preparation
1:58
Automated Feature Selection Using Image Analysis Software
6:58
Laser Microdissectionvvv
9:41
Protein Digestion by Pressure-Cycle Technology (PCT) and Sample Analysis Using Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS)
10:55
Results: Analysis of the Proteins in LMD-Enriched and Whole Tumor Samples
12:09
Conclusion
Transcript
यह प्रोटोकॉल ऊतक विभाजन के लिए एआई संचालित छवि विश्लेषण को एकीकृत करता है। लेजर माइक्रोडिसेक्शन द्वारा हिस्टोलॉजी चयनात्मक फसल के साथ और हमें पैथोमिक्स की वास्तविकता के करीब लाता है। एआई का उपयोग करके ऊतक आरओआई को पूर्वनिर्धारित करना, परिवेश के तापमान पर ऊतक स्लाइड के निवास समय को सीमित करता है, इन फसलों को करने के लिए जनशक्ति प्रयास को कम करता है और ऑपरेटर परिवर्तनशीलता को कम करता है।
यह तकनीक मोटे तौर पर ऊतक नमूनों से विशिष्ट सेलुलर आबादी के संग्रह या संवर्धन से जुड़े किसी भी बीमारी या पैथोलॉजी-आधारित अनुसंधान पर लागू होती है। यह विधि बुनियादी हिस्टोपैथोलॉजी ज्ञान और एलएमडी अनुभव वाले उपयोगकर्ताओं के लिए सरल है। कुंजी यह सुनिश्चित करना है कि आप कोशिकाओं के लिए साफ कैलिब्रेटर काटते हैं और क्लासिफायर को अच्छी तरह से प्रशिक्षित करते हैं।
शुरू करने के लिए, सुनिश्चित करें कि संदर्भ अंशांकन फिड्यूशियल काटने से पहले स्लाइड पूरी तरह से सूखी है। लेजर माइक्रोडिसेक्शन सॉफ़्टवेयर खोलें, और आयात आकृतियाँ विकल्प के तहत डिफ़ॉल्ट अंशांकन डॉट एसएलडी फ़ाइल खोलें। नीचे का सामना करना पड़ ऊतक और ऑपरेटर के करीब लेबल पक्ष के साथ स्लाइड लोड करें।
लेजर माइक्रोडिसेक्शन चरण पर स्लाइड धारक में, कट विकल्प से पहले ऑटो फोकस का चयन करें। लेजर माइक्रोस्कोप और डिफ़ॉल्ट अंशांकन डॉट एसएलडी फ़ाइल का उपयोग करके, पेन झिल्ली में अंशांकन फिड्यूशियल काट लें। केवल लेजर माइक्रोडिसेक्शन समृद्ध संग्रह के लिए, छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर खोलें।
खुली छवियों का चयन करें, और पॉपअप विंडो से, स्लाइड को स्कैन करने से उत्पन्न डॉट एसवीएस छवि फ़ाइल का चयन करें। एनोटेशन टैब पर नेविगेट करें, ऊतक के चारों ओर एक बॉक्स खींचने के लिए आयत एनोटेशन टूल का चयन करें और उपयोग करें। बॉक्स एनोटेशन का चयन करें और छवि पर राइट क्लिक करें।
उन्नत ड्रॉपडाउन मेनू का चयन करें, फिर विभाजन विकल्प पर क्लिक करें। टाइल आकार और स्थान को क्रमशः 500 और 40 के बीच सेट करें, और टाइल्स उत्पन्न करने के लिए ठीक का चयन करें। टाइल्स उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले परिधि बॉक्स एनोटेशन का चयन करें और हटाएं।
परत क्रियाएँ ड्रॉप डाउन मेनू का चयन करें, फिर टाइल वाले एनोटेशन को डॉट एनोटेशन फ़ाइल के रूप में सहेजने के लिए निर्यात पर क्लिक करें। पायथन डापा एल्गोरिथ्म की सहेजी गई प्रतिलिपि रखें, जिसे एआई वर्गीकृत एनोटेशन परतों को टाइल एनोटेशन फ़ाइल के समान फ़ोल्डर में विलय करने के लिए विकसित किया गया है। टाइल एनोटेशन फ़ाइल के नाम की प्रतिलिपि बनाएँ।
निष्क्रिय एकीकृत विकास वातावरण का उपयोग करके पायथन प्रोग्राम खोलें और प्रोग्राम के निचले भाग में उद्धरणों के बीच टाइल एनोटेशन फ़ाइल का नाम पेस्ट करें। रन ड्रॉपडाउन मेनू का चयन करें, फिर मॉड्यूल चलाएं क्लिक करें। कुछ फ़ाइल उत्पन्न होने की प्रतीक्षा करें जिसमें सभी टाइल वाले एनोटेशन एक परत के नीचे विलय हो जाएंगे।
छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर खोलें और एनोटेशन टैब पर नेविगेट करें। परत क्रियाएँ ड्रॉप डाउन मेनू का चयन करें, फिर छवि से सभी एनोटेशन को हटाने के लिए सभी परतों को हटाएं पर क्लिक करें। परत क्रियाएँ ड्रॉप डाउन मेनू का चयन करें, फिर स्थानीय एनोटेशन फ़ाइल आयात करें पर क्लिक करें।
पॉपअप विंडो में, स्क्रिप्ट द्वारा जनरेट किया गया था जो मर्ज किए गए डॉट एनोटेशन फ़ाइल का चयन करें। सुनिश्चित करें कि सभी आयातित टाइलें एक ही एनोटेशन परत के तहत हैं। क्लासिफायर टैब से, ट्यूमर, स्ट्रोमा और रिक्त ग्लास स्लाइड पृष्ठभूमि आरओआई के प्रतिनिधि क्षेत्रों को उजागर करने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें।
क्लासिफायर चलाने से पहले, उन्नत क्लासिफायर विकल्प पर क्लिक करें, आरओआई बॉक्स, या एनोटेशन टैब पर बक्से की जांच करके वांछित एनोटेशन परत का चयन करें। क्लासिफायर को चलाने के लिए क्लासिफायर क्रियामेनू से एनोटेशन लेयर विकल्प का उपयोग करें। एक बार क्लासिफायर विश्लेषण पूरा हो जाने के बाद, एनोटेशन टैब पर नेविगेट करें, और विश्लेषण से उत्पन्न एनोटेशन परत का चयन करें।
परत क्रियाएँ ड्रॉपडाउन मेनू का चयन करें, फिर छवि से अन्य सभी एनोटेशन परतों को हटाने के लिए सभी परतों को हटाएं लेकिन वर्तमान पर क्लिक करें। अगला, लेयर एक्शन ड्रॉप डाउन मेनू का चयन करें, फिर एनोटेशन को डॉट एनोटेशन फ़ाइल के रूप में सहेजने के लिए निर्यात पर क्लिक करें। सत्र या प्रोजेक्ट के लिए एक फ़ोल्डर बनाएँ और डॉट एनोटेशन फ़ाइल को किसी उप फ़ोल्डर के अंदर सहेजें।
स्लाइड के लिए अद्वितीय पहचानकर्ता के साथ लेबल किया गया. एनोटेशन टैब पर नेविगेट करें, लेयर एक्शन ड्रॉप डाउन का चयन करें, फिर छवि से सभी एनोटेशन को हटाने के लिए सभी परतों को हटाएं पर क्लिक करें। पेन टूल का चयन करें और प्रत्येक अंशांकन फिड्यूशियल से एक छोटी रेखा खींचें।
निम्नलिखित क्रम में चिह्नों से रेखाएँ आरेखित करें. ऊपर बाएं, ऊपर दाएं, नीचे दाएं। परत क्रियाएँ ड्रॉपडाउन मेनू का चयन करें, फिर टाइल वाले एनोटेशन को डू एनोटेशन फ़ाइल के रूप में सहेजने के लिए निर्यात पर क्लिक करें।
फ़ाइल नाम में अंडरस्कोर कैलिब जोड़ें और फ़ाइल को उस उप फ़ोल्डर में रखें जिसमें टाइल वाली आकृतियों के लिए निर्देशांक हैं। मुख्य प्रोजेक्ट के लिए पते की प्रतिलिपि बनाएँ। निष्क्रिय एकीकृत विकास वातावरण का उपयोग करके एक्सएमएल आयात जनरेटिंग स्क्रिप्ट मैलिएटर खोलें, फिर स्क्रिप्ट के निचले भाग में उद्धरणों के बीच प्रोजेक्ट फ़ोल्डर पता पेस्ट करें।
रन ड्रॉपडाउन मेनू का चयन करें, फिर स्क्रिप्ट निष्पादित करने के लिए रन मॉड्यूल पर क्लिक करें। लेजर माइक्रोस्कोप चरण पर स्लाइड धारक में नीचे का सामना करना पड़ ऊतक और लेबल पक्ष ऑपरेटर के करीब चिह्नित झिल्ली स्लाइड लोड करें। फ़ाइल ड्रॉपडाउन मेनू से आयात आकृतियों का चयन करें.
स्लाइड के लिए जनरेट की गई डॉट एक्सएमएल, एलएमडी आयात फ़ाइल का चयन करें। फ़ाइल से संदर्भ बिंदुओं को लोड करने से बचने के लिए पॉपअप विंडो में नहीं चुनें, और अंशांकन के लिए किसी भी पहले संग्रहीत संदर्भ बिंदुओं का उपयोग करने से बचने के लिए दूसरी पॉपअप विंडो में नहीं। लेजर सूक्ष्म विच्छेदन आवेदन से संकेतों का पालन करें और स्लाइड पर तीन अंशांकन फिड्यूशियल में से प्रत्येक के लिए अंशांकन पार संरेखित करें।
स्लाइड छवि के ऊपरी बाएँ, ऊपर दाएँ और निचले दाएँ में दिखाई देने वाले अंशांकन फिड्यूशियल की तलाश करें. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में जो माइक्रोस्कोप चरण पर उल्टे लेजर माइक्रोडिसेक्शन स्लाइड के संदर्भ बिंदुओं के अनुरूप होगा। पता लगाने के लिए 5x व्यक्तिपरक लेंस का उपयोग करने के बीच स्विच करें, और प्रत्येक अंशांकन फिड्यूशियल को संरेखित करने के लिए 63x व्यक्तिपरक लेंस।
संदर्भ बिंदुओं को फ़ाइल में सहेजने से बचने के लिए पॉपअप विंडो पर नहीं का चयन करें, और स्लाइड सम्मिलित होने की पुष्टि करने के लिए दूसरी पॉपअप विंडो में ठीक है। स्थिति में 5x व्यक्तिपरक लेंस ले जाएँ और वास्तविक आवर्धन का उपयोग करने के लिए पॉपअप विंडो में हाँ का चयन करें। एक बार आयातित आकार दिखाई देने के बाद, कैमरे को ऊतक पर केंद्रित करें।
आकृतियाँ सूची विंडो में सभी आकृतियों को हाइलाइट और चुनें. संदर्भ के रूप में देखने के क्षेत्र के भीतर एक या दो एनोटेशन का उपयोग करके उन्हें जगह में खींचें और लेजर के साथ काटने के लिए ऊर्ध्वाधर जेड-अक्ष संरेखित करें। पीसीटी माइक्रोट्यूब के लिए डिज़ाइन किए गए सार्वभौमिक ट्यूब धारक में ट्यूबों को लोड करें।
आयातित आकृतियों की समीक्षा करें और उन्हें संग्रह के लिए उपयुक्त ट्यूब स्थिति में असाइन करें। लेजर शुरू करने के लिए स्टार्ट कट दबाएं। एलएमडी ऊतकों के साथ नमूना ट्यूब को उतारें और बंद करें और सूखी बर्फ पर रखें।
थर्मोसाइक्लिंग और सेंट्रीफ्यूजिंग के बाद, एलएमडी ने ऊतक के नमूनों को काटा, पीसीटी माइक्रोट्यूब से माइक्रोकैप्स को हटा दिया और त्याग दिया। ट्रिप्सिन जोड़ें, प्रति 30 मिलीमीटर वर्ग ऊतक में एक माइक्रोग्राम का अनुपात जोड़ें। और माइक्रोकैप टूल का उपयोग करके माइक्रो ट्यूब में एक माइक्रो मूसल डालें।
माइक्रोट्यूब को बैरल चक्र कारतूस में स्थानांतरित करें और पूर्ण कारतूस इकट्ठा करें। कारतूस को बैरल चक्र दबाव कक्ष में रखें और ढक्कन को सुरक्षित करें। 50 सेकंड के लिए 45, 000 पीएसआई पर बैरल चक्र और 60 चक्रों के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर 10 सेकंड के लिए वायुमंडलीय दबाव।
एलसी-एमएस एमएस विश्लेषण के लिए, तरल क्रोमैटोग्राफी ऑटो सैंपलर में उपयुक्त पदों में ऑटो सैंपलर शीशियों को लोड करें। ऑटो नमूना बंद करें और एक उपयुक्त ढाल और मास स्पेक्ट्रोमेट्री विधि के साथ व्यक्तिगत अंशों का विश्लेषण करें। 100 सबसे चर प्रोटीन का उपयोग करके अपर्यवेक्षित पदानुक्रमित क्लस्टरिंग।
लेजर माइक्रोडिसेक्शन समृद्ध और पूरे ट्यूमर के नमूनों से उच्च ग्रेड सीरस डिम्बग्रंथि के कैंसर और डिम्बग्रंथि स्पष्ट सेल कार्सिनोमा हिस्टो प्रकारों के अलगाव के परिणामस्वरूप। इसके विपरीत, लेजर माइक्रोडिसेक्शन ने उच्च ग्रेड सीरस डिम्बग्रंथि के कैंसर और डिम्बग्रंथि स्पष्ट सेल कार्सिनोमा दोनों से स्ट्रोमा नमूनों को समृद्ध किया। लेजर माइक्रोडिसेक्शन समृद्ध ट्यूमर और पूरे ट्यूमर के नमूनों से एक साथ और स्वतंत्र रूप से क्लस्टर किया गया।
5, 971 मात्रा निर्धारित प्रोटीनों में से, 215 को उच्च ग्रेड सीरस डिम्बग्रंथि के कैंसर और डिम्बग्रंथि स्पष्ट सेल कार्सिनोमा नमूनों से पूरे ट्यूमर संग्रह के बीच काफी बदल दिया गया था। ह्यूजेस द्वारा मात्रा निर्धारित 76 हस्ताक्षर प्रोटीनों में से, 57 को इस डेटासेट में सह-मात्रा निर्धारित किया गया था और अत्यधिक सहसंबद्ध थे क्लासिफायर को प्रशिक्षित करना सबसे चुनौतीपूर्ण हिस्सा है। इंडिका लैब सॉफ्टवेयर निर्देशों का पालन करना और क्लासिफायर को परिष्कृत करना सबसे सटीक परिणामों को पुन: पेश करता है।
बाकी सब कुछ मानकीकृत है। इस एआई-संचालित एलएमडी वर्कफ़्लो का उपयोग करके काटा गया ऊतक विभिन्न प्रकार के डाउनस्ट्रीम विश्लेषणात्मक अनुप्रयोगों के साथ संगत है जिसमें यहां वर्णित मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित प्रोटिओमिक्स या जीनोमी, ट्रांसक्रिप्टोमिक या अन्य ओमिक विश्लेषण शामिल हैं।
यह प्रोटोकॉल लेजर माइक्रोडिसेक्शन का उपयोग करके हिस्टोलॉजी-हल सेल आबादी के संवर्धन के लिए सना हुआ, पतली ऊतक अनुभाग छवियों से ब्याज के पैथोलॉजी-पुष्टि क्षेत्रों के कृत्रिम बुद्धिमत्ता-संचालित विभाजन के लिए एक उच्च-थ्रूपुट वर्कफ़्लो का वर्णन करता है। इस रणनीति में एक उपन्यास एल्गोरिथ्म शामिल है जो सीधे लेजर माइक्रोस्कोप में ब्याज की सेल आबादी को दर्शाते हुए सीमांकन के हस्तांतरण को सक्षम करता है।
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved