Name: identifying caspases and their motifs that cleave proteins during influenza a virus infection
Uploaded: 2022-07-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identifying Caspases and their Motifs that Cleave Proteins During Influenza A Virus Infection at JoVE.com

המחבר מכיר את ג'ניפר טיפר, בילאן לי, ג'סי ואן ווסטרינן, קווין הרוד, דה-יואן צ'ן, פרג'אנה אחמד, סוניה מרוס, קנת ימאדה, ריצ'רד וובי, משאבי BEI (NIAID), המועצה לחקר הבריאות של ניו זילנד, קרן מוריס ופיליס פייקל (ניו זילנד), קרן H.S. ו- J.C. Anderson (דנידין), והמחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה ובית הספר למדעים ביו-רפואיים (אוניברסיטת אוטגו).

אישורים רגולטוריים התקבלו מוועדת הבטיחות הביולוגית המוסדית של אוניברסיטת אוטגו לעבודה עם IAV ותאי יונקים. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בכליות כלבים של Madin-Darby (MDCK) או בתאי אפיתל A549 של ריאה אנושית ובתת-סוגים של IAV H1N1. IAV גודל בביצי עוף, כפי שתואר במקום אחר17. תנאים סטריליים ואספטיים שימש?...

<ol>
	<li>Place, D. E., Lee, S., Kanneganti, T. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PANoptosis+in+microbial+infection.">PANoptosis in microbial infection.</a> Current Opinion in Microbiology. 59, 42-49 (2021).</li><li>Zheng, M., Kanneganti, T. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+the+ZBP1-NLRP3+inflammasome+and+its+implications+in+pyroptosis,+apoptosis,+and+necroptosis+(PANoptosis).">The regulation of the ZBP1-NLRP3 inflammasome and its implications in pyroptosis, apoptosis, and necroptosis (PANoptosis).</a> Immunological Reviews. 297 (1), 26-38 (2020).</li><li>Connolly, P. F., Fearnhead, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+hijacking+of+host+caspases:+An+emerging+category+of+pathogen-host+interactions.">Viral hijacking of host caspases: An emerging category of pathogen-host interactions.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 24 (8), 1401-1410 (2017).</li><li>Julien, O., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspases+and+their+substrates.">Caspases and their substrates.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 24 (8), 1380-1389 (2017).</li><li>Balachandran, S., Rall, G. F., Gack, M. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benefits+and+perils+of+necroptosis+in+influenza+virus+infection.">Benefits and perils of necroptosis in influenza virus infection.</a> Journal of Virology. 94 (9), 01101-01119 (2020).</li><li>Ampomah, P. B., Lim, L. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+A+virus-induced+apoptosis+and+virus+propagation.">Influenza A virus-induced apoptosis and virus propagation.</a> Apoptosis. 25 (1-2), 1-11 (2020).</li><li>Chen, D. Y., Husain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-mediated+degradation+of+host+cortactin+that+promotes+influenza+A+virus+infection+in+epithelial+cells.">Caspase-mediated degradation of host cortactin that promotes influenza A virus infection in epithelial cells.</a> Virology. 497, 146-156 (2016).</li><li>Galvin, H. D., Husain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+A+virus-induced+host+caspase+and+viral+PA-X+antagonize+the+antiviral+host+factor,+histone+deacetylase+4.">Influenza A virus-induced host caspase and viral PA-X antagonize the antiviral host factor, histone deacetylase 4.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (52), 20207-20221 (2019).</li><li>Husain, M., Harrod, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+A+virus-induced+caspase-3+cleaves+the+histone+deacetylase+6+in+infected+epithelial+cells.">Influenza A virus-induced caspase-3 cleaves the histone deacetylase 6 in infected epithelial cells.</a> FEBS Letters. 583 (15), 2517-2520 (2009).</li><li>Husain, M., Cheung, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+6+inhibits+influenza+A+virus+release+by+downregulating+the+trafficking+of+viral+components+to+the+plasma+membrane+via+its+substrate,+acetylated+microtubules.">Histone deacetylase 6 inhibits influenza A virus release by downregulating the trafficking of viral components to the plasma membrane via its substrate, acetylated microtubules.</a> Journal of Virology. 88 (19), 11229-11239 (2014).</li><li>Chen, D. Y., Husain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-mediated+cleavage+of+human+cortactin+during+influenza+A+virus+infection+occurs+in+its+actin-binding+domains+and+is+associated+with+released+virus+titres.">Caspase-mediated cleavage of human cortactin during influenza A virus infection occurs in its actin-binding domains and is associated with released virus titres.</a> Viruses. 12 (1), 87 (2020).</li><li>Zhirnov, O. P., Syrtzev, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+pathogenicity+is+determined+by+caspase+cleavage+motifs+located+in+the+viral+proteins.">Influenza virus pathogenicity is determined by caspase cleavage motifs located in the viral proteins.</a> Journal of Molecular and Genetic Medicine. 3 (1), 124-132 (2009).</li><li>Zhirnov, O. P., Klenk, H. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+caspase+cleavage+motifs+of+NP+and+M2+proteins+attenuate+virulence+of+a+highly+pathogenic+avian+influenza+virus.">Alterations in caspase cleavage motifs of NP and M2 proteins attenuate virulence of a highly pathogenic avian influenza virus.</a> Virology. 394 (1), 57-63 (2009).</li><li>Zhirnov, O. P., Konakova, T. E., Garten, W., Klenk, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-dependent+N-terminal+cleavage+of+influenza+virus+nucleocapsid+protein+in+infected+cells.">Caspase-dependent N-terminal cleavage of influenza virus nucleocapsid protein in infected cells.</a> Journal of Virology. 73 (12), 10158-10163 (1999).</li><li>Robinson, B. A., Van Winkle, J. A., McCune, B. T., Peters, A. M., Nice, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-mediated+cleavage+of+murine+norovirus+NS1/2+potentiates+apoptosis+and+is+required+for+persistent+infection+of+intestinal+epithelial+cells.">Caspase-mediated cleavage of murine norovirus NS1/2 potentiates apoptosis and is required for persistent infection of intestinal epithelial cells.</a> PLOS Pathogens. 15 (7), 1007940 (2019).</li><li>Richard, A., Tulasne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+cleavage+of+viral+proteins,+another+way+for+viruses+to+make+the+best+of+apoptosis.">Caspase cleavage of viral proteins, another way for viruses to make the best of apoptosis.</a> Cell Death &amp; Disease. 3 (3), 277 (2012).</li><li>Brauer, R., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+propagation+in+embryonated+chicken+eggs.">Influenza virus propagation in embryonated chicken eggs.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), e52421 (2015).</li><li>L&#252;thi, A. U., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CASBAH:+A+searchable+database+of+caspase+substrates.">The CASBAH: A searchable database of caspase substrates.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 14 (4), 641-650 (2007).</li><li>Kumar, S., van Raam, B. J., Salvesen, G. S., Cieplak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+cleavage+sites+in+the+human+proteome:+CaspDB,+a+database+of+predicted+substrates.">Caspase cleavage sites in the human proteome: CaspDB, a database of predicted substrates.</a> PLoS One. 9 (10), 110539 (2014).</li><li>Igarashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CutDB:+A+proteolytic+event+database.">CutDB: A proteolytic event database.</a> Nucleic Acids Research. 35 (Database issue). 35, 546-549 (2007).</li><li>Crawford, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DegraBase:+A+database+of+proteolysis+in+healthy+and+apoptotic+human+cells.">The DegraBase: A database of proteolysis in healthy and apoptotic human cells.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 12 (3), 813-824 (2013).</li><li>Rawlings, N. D., Tolle, D. P., Barrett, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEROPS:+The+peptidase+database.">MEROPS: The peptidase database.</a> Nucleic Acids Research. 32, 160-164 (2004).</li><li>Lange, P. F., Overall, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopFIND,+a+knowledgebase+linking+protein+termini+with+function.">TopFIND, a knowledgebase linking protein termini with function.</a> Nature Methods. 8 (9), 703-704 (2011).</li><li>Fortelny, N., Yang, S., Pavlidis, P., Lange, P. F., Overall, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+TopFIND+3.0+with+TopFINDer+and+PathFINDer:+Database+and+analysis+tools+for+the+association+of+protein+termini+to+pre-+and+post-translational+events.">Proteome TopFIND 3.0 with TopFINDer and PathFINDer: Database and analysis tools for the association of protein termini to pre- and post-translational events.</a> Nucleic Acids Research. 43, 290-297 (2015).</li></ol>

נקבע כי וירוסים מתאימים את הגורמים והמסלולים המארחים לטובתם. בתורו, התאים המארחים מתנגדים לכך על ידי שימוש באסטרטגיות שונות. אחת מאותן אסטרטגיות היא PANoptosis, שבה משתמשים תאים מארחים כאסטרטגיה אנטי-ויראלית נגד זיהומים בנגיף. עם זאת, וירוסים כמו IAV פיתחו אסטרטגיות משלהם כדי להתמודד עם PANoptosis ו?...

נגיף שפעת A (IAV) הוא חבר אב טיפוס במשפחת Orthomyxoviridae וידוע כגורם למגפות עולמיות ולמגפות בלתי צפויות. IAV גורם למחלה נשימתית אנושית, שפעת, הידועה בכינויה "שפעת". שפעת היא מחלה חריפה הגורמת להשראת תגובות חיסוניות מולדות פרו-דלקתיות ואנטי-דלקתיות ולמוות של תאי אפיתל בדרכי הנשימה האנושיות. שני התהליכים נשלטים על ידי תופעה הנקראת מוות תאי מתוכנת1. האיתות למוות תאי מתוכנת מושרה ברגע שקולטני זיהוי פתוגנים שונים חשים את חלקיקי הנגיף הנכנסים בתאים המארחים. זה מוביל לתכנות של מוות של תאים נגועים ואיתות לתאים בריאים שכנים על ידי שלושה מסלולים מחוברים הנקראים פירופטוזיס, אפופטוזיס ונקרופטוזיס - שנטבעו לאחרונה כתהליך אחד, PANoptosis1.
PANoptosis כרוך בעיבוד פרוטאוליטי של חלבונים רבים של פונדקאים ונגיפים משלב האינדוקציה ועד לביצוע. עיבוד כזה של חלבונים מובל בעיקר על ידי משפחה של פרוטאזות ציסטאין הנקראות קספאזות 1,2. עד 18 קספאזות (מקספאזה 1 עד קספאזה 18) ידועות3. רוב הקספאזות מבוטאות כפרו-קספאזות ומופעלות על ידי עיבוד פרוטאוליטי משלהן על ידי אוטוקטליזה או קספאזותאחרות 4 בתגובה לגירוי כמו זיהום בווירוס. ה-PANoptosis של תאים נגועים ב-IAV נחשב למנגנון הגנה מארח, אך IAV פיתח דרכים להתחמק ממנו ולנצל אותו כדי להקל על שכפולו 1,2,5,6. אחד מהם הוא לנטרל את הגורמים המארחים באמצעות ביקוע או השפלה בתיווך קספאז שהם אנטי-ויראליים מטבעם או מפריעים לאחד השלבים במחזור החיים של ה-IAV. לשם כך התגלו גורמים מארחים, קורטקטין, HDAC4 ו-HDAC6 שעברו ביקוע או השפלה בתיווך קספאז בתאי אפיתל נגועים ב-IAV 7,8,9. ה-HDAC4 וה-HDAC6 הם גורמים אנטי-IAV8,10, והקורטקטין מפריע לשכפול ה-IAV בשלב מאוחר יותר של ההדבקה, באופן פוטנציאלי במהלך הרכבת הנגיף וניצנים 11.
בנוסף, מופעלות גם קספאזות שונות, אשר בתורן מבקעות חלבונים מרובים כדי להפעיל את התגובה הדלקתית של המארח במהלך זיהום ב- IAV 1,2. יתר על כן, נוקליאופרוטאין (NP), חלבון M2 תעלת יונים של IAV 12,13,14, וחלבונים שונים של נגיפים אחרים 3,15,16 עוברים גם הם ביקוע בתיווך קספאז במהלך ההדבקה, המשפיע על פתוגנזה נגיפית. לכן, יש צורך מתמשך לחקור ביקוע בתיווך קספאז או השפלה של חלבונים מארחים ונגיפיים במהלך IAV וזיהומים נגיפיים אחרים כדי להבין את הבסיס המולקולרי של פתוגנזה נגיפית. כאן מוצגות השיטות כדי (1) להעריך את הבקיעה או הפירוק של חלבונים כאלה על ידי קספאזות, (2) לזהות את הקספאזות האלה, ו-(3) לאתר את אתרי הבקיעה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A549 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRM-CCL-185</td>
			<td>Human, epithelial, lung</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspase 3 Inhibitor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>264156-M</td>
			<td>Also known as &#39;InSolution Caspase-3 Inhibitor II - Calbiochem&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-NP antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gift from Richard Webby (St Jude Children&#8217;s Research Hospital, Memphis, USA) to MH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13778150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDCK cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-34</td>
			<td>Dog, epithelial, kidney</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MG132</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium (MEM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11095080</td>
			<td>Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MISSION siRNA Universal Negative Control #1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SIC001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2&#160;</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td></td>
			<td>Odyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>50728</td>
			<td>Gift from Kenneth Yamada to Addgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NM_004346</td>
			<td>siRNA ID: SASI_Hs01_00139105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-designed small interferring RNA to caspase 6</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NM_001226</td>
			<td>siRNA ID: SASI_Hs01_00019062</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-designed small interferring RNA to caspase 7</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NM_001227</td>
			<td>siRNA ID: SASI_Hs01_00128361</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairs</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>KSPQ12012</td>
			<td>Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protran Premium nitrocellulose membrane</td>
			<td>Cytiva (Fomerly GE Healthcare)</td>
			<td>10600003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-actin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-cortactin antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFP antibody</td>
			<td>Takara</td>
			<td>632592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeeBlue Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC5625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection medium, Opti-MEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, TPCK-Treated</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>4370285</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying caspases and their motifs that cleave proteins during influenza a virus infection

Caspases, משפחה של פרוטאזות ציסטאין, מתזמרת מוות תאי מתוכנת בתגובה לגירויים שונים, כולל זיהומים מיקרוביאליים. מוות תאי מתוכנת, שתואר בתחילה כמתרחש על ידי אפופטוזיס, ידוע כיום כמקיף שלושה מסלולים הקשורים זה בזה: פירופטוזיס, אפופטוזיס ונקרופטוזיס, יחד נטבעו כתהליך אחד, PANoptosis. השפעה זיהום בנגיף (IAV) משרה PANoptosis בתאי יונקים על ידי גרימת הפעלה של קספאזות שונות, אשר בתורן מבקעות חלבונים מארחים שונים כמו גם ויראליים, מה שמוביל לתהליכים כמו הפעלת התגובה האנטי-ויראלית המולדת של המארח או השפלה של חלבונים מארחים אנטגוניסטיים. בהקשר זה, ביקוע קספאז 3 בתיווך של קורטקטין מארח, היסטון דאצטילאז 4 (HDAC4) והיסטון דאצטילאז 6 (HDAC6) התגלה הן בתאי אפיתל של בעלי חיים והן בתאי אפיתל אנושיים בתגובה לזיהום ב- IAV. כדי להדגים זאת, נעשה שימוש במעכבים, הפרעות RNA ומוטגנזה מכוונת אתר, ולאחר מכן, הבקיעה או ההתנגדות לביקוע וההתאוששות של פוליפפטידים של קורטקטין, HDAC4 ו- HDAC6 נמדדו על ידי כתם מערבי. שיטות אלה, בשילוב עם RT-qPCR, יוצרות אסטרטגיה פשוטה אך יעילה לזיהוי הפונדקאי, כמו גם חלבונים נגיפיים העוברים ביקוע בתיווך קספאז במהלך זיהום של IAV או נגיפים אחרים בבני אדם ובבעלי חיים. הפרוטוקול הנוכחי מפרט את התוצאות המייצגות של אסטרטגיה זו, והדרכים להפוך אותה ליעילה יותר נדונות גם הן.

טיפול במעכב קספז 3 התגלה כי פוליפפטידים של קורטקטין מארח, HDAC4 ו-HDAC6 עוברים פירוק בתגובה לזיהום ב-IAV הן בתאי הכלבים (MDCK) והן בתאי האדם (A549, NHBE) 7,8,9. על ידי שימוש בגישות הנ"ל, נחשף כי קספאזות מארחות המושרות על ידי IAV, במיוחד caspase 3, גורמות ?...

Watch this Scientific Journal Video about Identifying Caspases and their Motifs that Cleave Proteins During Influenza A Virus Infection at JoVE.com

Identifying Caspases and their Motifs that Cleave Proteins During Influenza A Virus Infection

זיהום בנגיף שפעת A (IAV) מפעיל את הקספאזות שמבקעות חלבונים פונדקאיים ונוגפיים, אשר בתורם הם בעלי תפקידים פרו-ויראליים. על ידי שימוש במעכבים, הפרעות RNA, מוטגנזה מכוונת אתר, וטכניקות כתם מערביות ו- RT-qPCR, זוהו קספאזות בתאי יונקים נגועים המבקעים קורטקטין מארח והיסטון דאקטילאזות.

זיהוי קספאזות והמוטיבים שלהן שמבקעים חלבונים במהלך הידבקות בנגיף שפעת A

Caspases, a family of cysteine proteases, orchestrate programmed cell death in response to various stimuli, including microbial infections. Initially ...

שיטה זו תסייע לקבוע ולאשר אם חלבון בתאים נגועים בנגיף שפעת עובר השפלה או ביקוע על ידי caspases ולזהות את אתרי הבקיעה caspase. שיטה זו דורשת רק הגדרות מעבדה בסיסיות לביולוגיה מולקולרית ותאית ומיומנויות מחקר ואינה דורשת כל ציוד מיוחד או הכשרה בתוכנה. ניתן להתאים שיטה זו להשגת מטרות דומות הכוללות הדבקה בנגיפים או במיקרובים אחרים מן החי, וחשיפה לגירויים חיצוניים, כמו רעלנים וכימיקלים.כדי להתחיל, זרע תאי MDCK או A549 בצלחת תרבית תאים של 12 באר. לדגור על התאים במשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תחת אטמוספירה של 5% פחמן דו-חמצני. למחרת, הסר את מדיום התרבית הישן מהתאים ושטוף את התאים בכל באר פעמיים עם מיליליטר אחד של MEM ללא סרום.לאחר מכן, להדביק את התאים על ידי הוספת 400 microliters של שפעת A וירוס inoculum, ומניחים את הצלחת עבור הדגירה במשך שעה אחת. לאחר הדגירה, להסיר את הנגיף inoculum ולשטוף את התאים עם MEM. הוסף מיליליטר אחד של MEM ללא סרום לכל באר ודגירה של התאים כפי שמוצג בשלב הקודם.לאחר 24 שעות, לקצור את התאים על ידי גירוד אותם עם בוכנה מזרק של מיליליטר אחד ולהעביר אותם צינור 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה את הצינור ב 12, 000G במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר לאסוף את supernatant. לשטוף את כדור התא עם 250 microliters של מלח חוצץ פוספט צנטריפוגה.הסר את supernatant ולהוסיף 100 microliters של מאגר תזה תאים. מערבבים לפי מערבולת. מחממים את הצינור ב 98 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי lyse לחלוטין את התאים.לאחר מכן, פתור כמויות שוות של חלבון מדגימות לא נגועות ונגועות על ידי אלקטרופורזה סטנדרטית של ג'ל פוליאקרילאמיד SDS. לאחר אלקטרופורזה, מעבירים את ג'ל החלבון לקרום ניטרוצלולוז או PVDF ומבצעים כתם מערבי. השווה את רמות החלבון בנתיבי הדגימה הנגועים שטופלו במדומה ובמעכבים.ב-100 מיקרוליטרים של מדיום מתאים, כמו Opti-MEM, מדללים 100 ננו-מולרים של בקרה או קספאז siRNA, או נפח מתאים של מגיב טרנספקציה. לדגור במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. מערבבים 100 מיקרוליטרים מכל תמיסת siRNA עם 100 מיקרוליטרים של תמיסת מגיב טרנספקציה ומדגרים במשך 20 עד 45 דקות בטמפרטורת החדר.לפצל ולהוסיף 100, 000 תאי MDCK או A549 ב 800 microliters של מדיום הצמיחה המלא. הוסיפו 200 מיקרוליטרים של קומפלקס מגיבי טרנספקציה של siRNA והוסיפו את התרחיף הזה לצלחת תרבית של 12 בארות. לדגור על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תחת אטמוספירה של 5% פחמן דו חמצני במשך 72 שעות.להדביק את התאים עם וירוס שפעת A, אבל ללא מעכבים. בצע כתם מערבי, והשווה את רמות החלבון כפי שהוצג קודם לכן. אתרו את מוטיבים המחשוף הקספאזי XXXD ו-DXXD על הפוליפפטיד.מוטציה של חומצה אספרטית P1, שתי חומצות גלוטמיות, או אלנין על ידי מוטגנזה מכוונת אתר ואישור על ידי ריצוף DNA. ב-100 מיקרוליטרים של מדיום מתאים, יש לדלל שני מיקרוגרמים של דנ"א פלזמה מסוג בר או מוטציה או נפח מומלץ של מגיב הטרנספקציה ולדגירה של הצינורות במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. מערבבים 100 מיקרוליטרים של תמיסת DNA פלזמה עם 100 מיקרוליטרים של תמיסת מגיב הטרנספקציה ודוגרים במשך 20 עד 45 דקות בטמפרטורת החדר.בינתיים, לפצל ולהוסיף 300, 000 MDCK או A549 תאים ל 800 microliters של בינוני צמיחה מלאה. הוסף 200 מיקרוליטרים של קומפלקס מגיב טרנספקציה DNA והוסף את המתלה הזה לצלחת תרבית של 12 בארות. לדגום את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תחת אטמוספירה של 5% פחמן דו חמצני.לאחר 48 שעות, להדביק את התאים עם וירוס שפעת A ללא מעכבים. בצע כתם מערבי, והשווה את רמות החלבון כפי שהוצג קודם לכן. באמצעות הכתמה מערבית, הוערכה ההשפלה של קורטקטין מארח על ידי קספאזות פונדקאיות הנגרמות על ידי שפעת.טיפול בתאים נגועים בנגיף השפעת עם מעכב קספאז-3 הביא להצלת קורטקטין ופירוק NP נגיפי. כימות עוצמת רצועות הקורטקטין והנורמליזציה שלו עם רצועת האקטין המתאימה הראו כי רמת הקורטקטין בתאים נגועים שטופלו במעכבי קספאז-3 הייתה גבוהה יותר בהשוואה לתאים נגועים שלא טופלו. בתאים מדולדלים של קספאז-6 או קספאז-7.לא נצפתה התאוששות משמעותית ברמות הפוליפפטידים של קורטקטין, ואילו בתאים מדולדלים של קספאז-3, קורטקטין שהתאושש מנגיף השפעת גרם להתפרקות. כימות והשוואה של רמות הפוליפפטידים הראו כי רמת הפוליפפטיד של קורטקטין בתאים נגועים עם ביטוי קספאזי-3 מדולדל הייתה גבוהה יותר מאשר תאים עם ביטוי קספאז-3 רגיל. המוטציה של חומצה אספרטית בעמדה 116 לחומצה גלוטמית הפכה את הפוליפפטיד של הקורטקטין לעמיד בפני השפלה הנגרמת על ידי נגיף השפעת.כימות והשוואה של רמות הפוליפפטידים הראו כי רמת הפוליפפטיד של קורטקטין מוטנטי בתאים נגועים הייתה גבוהה מזו של פוליפפטיד קורטקטין מסוג בר. הוא נדרש ליצור עשרות מוטנטים ולבצע כתמים מערביים חוזרים ונשנים כדי לזהות את אתר המחשוף הקספאזי בפוליפפטיד. ניתן לפתח בדיקה ביוכימית במבחנה המכילה קספאז מטוהר ופוליפפטיד מטרה כדי לאשר שהחלבון המעניין הוא מצע מבוסס גז ישיר.פרוטוקול זה יסייע להבין את המשמעות, ההשפלה או הבקיעה של חלבון המטרה במערכת הנחקרת, כגון זיהום בנגיף או מחלה.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

הדור של וירוס שפעת רקומביננטי מ-DNA פלסמיד

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

באמצעות הדמיה Bioluminescent לחקור סינרגיזם בין Streptococcus pneumoniae ו שפעת וירוס עכברים תינוקות

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

תפוקה גבוהה איתור שיטת וירוס השפעת

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners

זיהוי של מוטיבים פונקציונליים והשותפים המחייבים מבוסס פפטיד

Specific short  peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1  Nef, not only retain their biological function, but can ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

רביה וירוס השפעת בembryonated עוף ביצים

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

שיתוף immunoprecipitation של חלבון העכבר MX1 עם nucleoprotein וירוס השפעת

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

האף מגבונים לשפעת זיהוי וירוסים ובידוד מחזירים

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

במבחנה פירוק של וירוס שפעת capsids ידי צנטריפוגה שיפוע

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

קרינה המבוססת Assay Neuraminidase העיכוב להעריך את הרגישות של שפעת וירוסים אל Neuraminidase המונע המחלקה של תרופות אנטי-ויראליות

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...