Name: identifying caspases and their motifs that cleave proteins during influenza a virus infection
Uploaded: 2022-07-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identifying Caspases and their Motifs that Cleave Proteins During Influenza A Virus Infection at JoVE.com

L'autore riconosce Jennifer Tipper, Bilan Li, Jesse vanWestrienen, Kevin Harrod, Da-Yuan Chen, Farjana Ahmed, Sonya Mros, Kenneth Yamada, Richard Webby, BEI Resources (NIAID), Health Research Council of New Zealand, Maurice and Phyllis Paykel Trust (Nuova Zelanda), H.S. and J.C. Anderson Trust (Dunedin), Dipartimento di Microbiologia e Immunologia e Scuola di Scienze Biomediche (Università di Otago).

Le approvazioni normative sono state ottenute dal Comitato istituzionale per la sicurezza biologica dell'Università di Otago per lavorare con IAV e cellule di mammifero. Per il presente studio sono state utilizzate cellule A549 del rene canino Madin-Darby (MDCK) o epitelio alveolare polmonare umano e sottotipi IAV H1N1. IAV è stato coltivato in uova di gallina, come descritto altrove17. Le condizioni sterili e asettiche sono state utilizzate per lavorare con cellule di mammifero e sono state uti...

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P., Klenk, H. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+caspase+cleavage+motifs+of+NP+and+M2+proteins+attenuate+virulence+of+a+highly+pathogenic+avian+influenza+virus.">Alterations in caspase cleavage motifs of NP and M2 proteins attenuate virulence of a highly pathogenic avian influenza virus.</a> Virology. 394 (1), 57-63 (2009).</li><li>Zhirnov, O. P., Konakova, T. E., Garten, W., Klenk, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-dependent+N-terminal+cleavage+of+influenza+virus+nucleocapsid+protein+in+infected+cells.">Caspase-dependent N-terminal cleavage of influenza virus nucleocapsid protein in infected cells.</a> Journal of Virology. 73 (12), 10158-10163 (1999).</li><li>Robinson, B. A., Van Winkle, J. A., McCune, B. T., Peters, A. M., Nice, T. 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È stabilito che i virus adattano i fattori e i percorsi dell'ospite a loro vantaggio. A loro volta, le cellule ospiti resistono a ciò impiegando varie strategie. Una di queste strategie è la PANoptosis, che le cellule ospiti usano come strategia antivirale contro le infezioni virali. Tuttavia, virus come IAV hanno evoluto le proprie strategie per contrastare la PANoptosi e sfruttarla a loro vantaggio 1,3,6. Questa interazione...

Il virus dell'influenza A (IAV) è il membro prototipo della famiglia Orthomyxoviridae ed è noto per causare epidemie globali e pandemie imprevedibili. IAV causa malattie respiratorie umane, influenza, comunemente noto come "influenza". L'influenza è una malattia acuta che provoca l'induzione di risposte immunitarie innate pro- e anti-infiammatorie dell'ospite e la morte delle cellule epiteliali nel tratto respiratorio umano. Entrambi i processi sono governati da un fenomeno chiamato morte cellulare programmata1. La segnalazione per la morte cellulare programmata viene indotta non appena vari recettori di riconoscimento dei patogeni rilevano le particelle virali in arrivo nelle cellule ospiti. Ciò porta alla programmazione della morte delle cellule infette e alla segnalazione alle cellule sane vicine attraverso tre percorsi interconnessi chiamati piroptosi, apoptosi e necroptosi, recentemente coniati come un unico processo, PANoptosis1.
La PANoptosi comporta l'elaborazione proteolitica di molte proteine dell'ospite e virali dall'induzione all'esecuzione. Tale elaborazione delle proteine è principalmente guidata da una famiglia di proteasi della cisteina chiamate caspasi 1,2. Sono note fino a 18 caspasi (dalla caspasi 1 alla caspasi 18)3. La maggior parte delle caspasi sono espresse come pro-caspasi e attivate subendo il proprio processo proteolitico mediante autocatalisi o altre caspasi4 in risposta a uno stimolo come un'infezione virale. Si pensava che la PANoptosi delle cellule infette da IAV fosse un meccanismo di difesa dell'ospite, ma IAV ha evoluto modi per eludere e sfruttarlo per facilitare la sua replicazione 1,2,5,6. Uno di questi è quello di antagonizzare i fattori dell'ospite attraverso la scissione o la degradazione mediata dalla caspasi che sono intrinsecamente antivirali o interferiscono con una delle fasi del ciclo di vita IAV. A tal fine, è stato scoperto che i fattori dell'ospite, cortactina, HDAC4 e HDAC6 subiscono una scissione o degradazione mediata da caspasi nelle cellule epiteliali infette da IAV 7,8,9. HDAC4 e HDAC6 sono fattori anti-IAV 8,10 e la cortactina interferisce con la replicazione IAV in una fase successiva dell'infezione, potenzialmente durante l'assemblaggio virale e il germogliamento 11.
Inoltre, vengono attivate anche varie caspasi che, a loro volta, scindono più proteine per attivare la risposta infiammatoria dell'ospite durante l'infezione IAV 1,2. Inoltre, la nucleoproteina (NP), la proteina M2 del canale ionico di IAV 12,13,14 e varie proteine di altri virus 3,15,16 subiscono anche una scissione mediata da caspasi durante l'infezione, che influenza la patogenesi virale. Pertanto, vi è una continua necessità di studiare la scissione mediata dalla caspasi o la degradazione delle proteine dell'ospite e virali durante le infezioni da IAV e altri virus per comprendere le basi molecolari della patogenesi virale. Qui, i metodi sono presentati per (1) valutare la scissione o la degradazione di tali proteine da parte delle caspasi, (2) identificare tali caspasi e (3) individuare i siti di scissione.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A549 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRM-CCL-185</td>
			<td>Human, epithelial, lung</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspase 3 Inhibitor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>264156-M</td>
			<td>Also known as &#39;InSolution Caspase-3 Inhibitor II - Calbiochem&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-NP antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gift from Richard Webby (St Jude Children&#8217;s Research Hospital, Memphis, USA) to MH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13778150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDCK cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-34</td>
			<td>Dog, epithelial, kidney</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MG132</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium (MEM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11095080</td>
			<td>Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MISSION siRNA Universal Negative Control #1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SIC001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2&#160;</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td></td>
			<td>Odyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>50728</td>
			<td>Gift from Kenneth Yamada to Addgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NM_004346</td>
			<td>siRNA ID: SASI_Hs01_00139105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-designed small interferring RNA to caspase 6</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NM_001226</td>
			<td>siRNA ID: SASI_Hs01_00019062</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-designed small interferring RNA to caspase 7</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NM_001227</td>
			<td>siRNA ID: SASI_Hs01_00128361</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairs</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>KSPQ12012</td>
			<td>Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protran Premium nitrocellulose membrane</td>
			<td>Cytiva (Fomerly GE Healthcare)</td>
			<td>10600003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-actin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-cortactin antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFP antibody</td>
			<td>Takara</td>
			<td>632592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeeBlue Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC5625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection medium, Opti-MEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, TPCK-Treated</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>4370285</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying caspases and their motifs that cleave proteins during influenza a virus infection

Le caspasi, una famiglia di proteasi della cisteina, orchestrano la morte cellulare programmata in risposta a vari stimoli, comprese le infezioni microbiche. Inizialmente descritta per verificarsi per apoptosi, la morte cellulare programmata è ora nota per comprendere tre percorsi interconnessi: piroptosi, apoptosi e necroptosi, insieme coniati come un unico processo, PANoptosis. L'infezione da virus Influenza A (IAV) induce la PANoptosi nelle cellule di mammifero inducendo l'attivazione di diverse caspasi, che, a loro volta, scindono varie proteine dell'ospite e virali, portando a processi come l'attivazione della risposta antivirale innata dell'ospite o la degradazione delle proteine antagoniste dell'ospite. A questo proposito, la scissione mediata dalla caspasi 3 della cortactina ospite, dell'istone deacetilasi 4 (HDAC4) e dell'istone deacetilasi 6 (HDAC6) è stata scoperta in cellule epiteliali sia animali che umane in risposta all'infezione da IAV. Per dimostrare ciò, sono stati impiegati inibitori, interferenze dell'RNA e mutagenesi diretta al sito e, successivamente, la scissione o resistenza alla scissione e il recupero dei polipeptidi cortactina, HDAC4 e HDAC6 sono stati misurati mediante western blotting. Questi metodi, in combinazione con RT-qPCR, formano una strategia semplice ma efficace per identificare l'ospite e le proteine virali che subiscono la scissione mediata dalla caspasi durante un'infezione di IAV o altri virus umani e animali. Il presente protocollo elabora i risultati rappresentativi di questa strategia e vengono anche discussi i modi per renderla più efficace.

Trattamento con inibitore della caspasi 3 È stato scoperto che i polipeptidi di cortactina ospite, HDAC4 e HDAC6 subiscono degradazione in risposta all'infezione da IAV sia nelle cellule canine (MDCK) che umane (A549, NHBE) 7,8,9. Utilizzando gli approcci di cui sopra, è stato scoperto che le caspasi ospiti indotte da IAV, in particolare la caspasi 3, causano la loro degradazione <su...

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Identifying Caspases and their Motifs that Cleave Proteins During Influenza A Virus Infection

L'infezione da virus dell'influenza A (IAV) attiva le caspasi che scindono le proteine dell'ospite e virali, che, a loro volta, hanno funzioni pro e antivirali. Utilizzando inibitori, interferenza dell'RNA, mutagenesi sito-diretta e tecniche di western blotting e RT-qPCR, sono state identificate caspasi in cellule di mammifero infette che scindono la cortactina ospite e le deacetilasi istoniche.

Identificare le caspasi e i loro motivi che scindono le proteine durante l'infezione da virus dell'influenza A

Caspases, a family of cysteine proteases, orchestrate programmed cell death in response to various stimuli, including microbial infections. Initially ...

Questo metodo aiuterà a determinare e confermare se una proteina nelle cellule infette da virus dell'influenza subisce degradazione o scissione da parte delle caspasi e identificare i siti di scissione delle caspasi. Questo metodo richiede solo impostazioni di laboratorio di biologia molecolare e cellulare di base e capacità di ricerca e non richiede alcuna attrezzatura specializzata o formazione software. Questo metodo può essere adattato per raggiungere obiettivi simili che coinvolgono l'infezione con altri virus animali o microbi e l'esposizione a stimoli esterni, come tossine e sostanze chimiche.Per iniziare, seminare cellule MDCK o A549 in una piastra di coltura cellulare a 12 pozzetti. Incubare le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius sotto un'atmosfera di anidride carbonica del 5%. Il giorno successivo, rimuovere il vecchio terreno di coltura dalle cellule e lavare le cellule in ciascun pozzetto due volte con un millilitro di MEM senza siero.Quindi, infettare le cellule aggiungendo 400 microlitri di inoculo del virus dell'influenza A e posizionare la piastra per l'incubazione per un'ora. Dopo l'incubazione, rimuovere l'inoculo del virus e lavare le cellule con MEM. Aggiungere un millilitro di MEM senza siero a ciascun pozzetto e incubare le cellule come mostrato nel passaggio precedente.Dopo 24 ore, raccogliere le cellule raschiandole con uno stantuffo della siringa da un millilitro e trasferirle in un tubo da 1,5 millilitri. Centrifugare il tubo a 12.000 G per due minuti a temperatura ambiente e raccogliere il surnatante. Lavare il pellet cellulare con 250 microlitri di soluzione salina tamponata fosfato e centrifugare.Rimuovere il surnatante e aggiungere 100 microlitri di tampone per lisi cellulare. Mescolare per vortice. Riscaldare il tubo a 98 gradi Celsius per 10 minuti per lisare completamente le cellule.Quindi, risolvere quantità uguali di proteine da campioni non infetti e infetti mediante elettroforesi standard su gel di poliacrilammide SDS. Dopo l'elettroforesi, trasferire il gel proteico su una membrana nitrocellulosa o PVDF ed eseguire Western blotting. Confronta i livelli di proteine nelle corsie campione infette trattate con finzione e inibitori.In 100 microlitri di mezzo appropriato, come Opti-MEM, diluire 100 nanomolari di controllo o siRNA caspasi, o volume appropriato di reagente di trasfezione. Incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Mescolare 100 microlitri di ciascuna soluzione di siRNA con 100 microlitri di soluzione di reagente di trasfezione e incubare per 20-45 minuti a temperatura ambiente.Dividere e aggiungere 100.000 cellule MDCK o A549 in 800 microlitri del mezzo di coltura completo. Aggiungere 200 microlitri di complesso reagente di trasfezione siRNA e aggiungere questa sospensione a una piastra di coltura a 12 pozzetti. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius sotto un'atmosfera di anidride carbonica del 5% per 72 ore.Infettare le cellule con il virus dell'influenza A, ma senza inibitori. Eseguire Western blotting e confrontare i livelli di proteine come mostrato in precedenza. Individuare i motivi di scissione delle caspasi XXXD e DXXD sul polipeptide.Mutare l'acido aspartico P1, due acidi glutammici o alanina mediante mutagenesi sito-diretta e confermare mediante sequenziamento del DNA. In 100 microlitri di un mezzo appropriato, diluire due microgrammi di DNA plasmatico wild-type o mutante o volume raccomandato del reagente di trasfezione e incubare le provette per cinque minuti a temperatura ambiente. Mescolare 100 microlitri di soluzione di DNA plasmatico con 100 microlitri della soluzione di reagente di trasfezione e incubare per 20-45 minuti a temperatura ambiente.Nel frattempo, dividere e aggiungere 300.000 cellule MDCK o A549 a 800 microlitri di terreno di coltura completo. Aggiungere 200 microlitri di complesso reagente di trasfezione del DNA e aggiungere questa sospensione a una piastra di coltura a 12 pozzetti. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius sotto un'atmosfera di anidride carbonica del 5%.Dopo 48 ore, infettare le cellule con il virus dell'influenza A senza inibitori. Eseguire Western blotting e confrontare i livelli di proteine come mostrato in precedenza. Utilizzando Western blotting, è stata valutata la degradazione della cortactina ospite da parte delle caspasi dell'ospite indotte dall'influenza.Il trattamento delle cellule infette dal virus dell'influenza con un inibitore della caspasi-3 ha portato al salvataggio della cortactina e della degradazione virale delle NP. La quantificazione dell'intensità delle bande di cortactina e la sua normalizzazione con la corrispondente banda di actina ha mostrato che il livello di cortactina nelle cellule infette trattate con inibitore della caspasi-3 era più alto rispetto alle cellule infette non trattate. Nelle cellule impoverite di caspasi-6 o caspasi-7.Non è stato osservato alcun recupero significativo dei livelli di polipeptide della cortactina, mentre nelle cellule impoverite della caspasi-3, la cortactina si è ripresa dalla degradazione indotta dal virus dell'influenza. La quantificazione e il confronto dei livelli di polipeptidi hanno mostrato che il livello di polipeptide della cortactina nelle cellule infette con espressione impoverita di caspasi-3 era superiore rispetto alle cellule con espressione normale di caspasi-3. La mutazione dell'acido aspartico in posizione 116 in acido glutammico ha reso il polipeptide della cortactina resistente alla degradazione indotta dal virus dell'influenza.La quantificazione e il confronto dei livelli di polipeptidi hanno mostrato che il livello di polipeptide cortactina mutante nelle cellule infette era superiore a quello del polipeptide cortactina wild-type. È necessario generare decine di mutanti ed eseguire ripetute macchie occidentali per identificare il sito di scissione delle caspasi nel polipeptide. Un saggio biochimico in vitro contenente caspasi purificata e polipeptide bersaglio potrebbe essere sviluppato per confermare che la proteina di interesse è un substrato diretto a base di gas.Questo protocollo aiuterà a comprendere il significato, la degradazione o la scissione della proteina bersaglio nel sistema che viene studiato, come l'infezione da virus o una malattia.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Ricerca

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