Name: identifying caspases and their motifs that cleave proteins during influenza a virus infection
Uploaded: 2022-07-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identifying Caspases and their Motifs that Cleave Proteins During Influenza A Virus Infection at JoVE.com

El autor reconoce a Jennifer Tipper, Bilan Li, Jesse vanWestrienen, Kevin Harrod, Da-Yuan Chen, Farjana Ahmed, Sonya Mros, Kenneth Yamada, Richard Webby, BEI Resources (NIAID), el Health Research Council of New Zealand, el Maurice and Phyllis Paykel Trust (Nueva Zelanda), el H.S. and J.C. Anderson Trust (Dunedin), y el Departamento de Microbiología e Inmunología y la Facultad de Ciencias Biomédicas (Universidad de Otago).

Se obtuvieron aprobaciones regulatorias del Comité Institucional de Seguridad Biológica de la Universidad de Otago para trabajar con el IAV y las células de mamíferos. Para el presente estudio se utilizó el riñón canino Madin-Darby (MDCK) o células epiteliales a549 alveolares de pulmón humano y subtipos IAV H1N1. El IAV se cultivó en huevos de gallina, como se describe en otra parte17. Se utilizaron condiciones estériles y asépticas para trabajar con células de mamíferos, y se utiliz...

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P., Klenk, H. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+caspase+cleavage+motifs+of+NP+and+M2+proteins+attenuate+virulence+of+a+highly+pathogenic+avian+influenza+virus.">Alterations in caspase cleavage motifs of NP and M2 proteins attenuate virulence of a highly pathogenic avian influenza virus.</a> Virology. 394 (1), 57-63 (2009).</li><li>Zhirnov, O. P., Konakova, T. E., Garten, W., Klenk, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-dependent+N-terminal+cleavage+of+influenza+virus+nucleocapsid+protein+in+infected+cells.">Caspase-dependent N-terminal cleavage of influenza virus nucleocapsid protein in infected cells.</a> Journal of Virology. 73 (12), 10158-10163 (1999).</li><li>Robinson, B. A., Van Winkle, J. A., McCune, B. T., Peters, A. M., Nice, T. 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Se establece que los virus adaptan los factores y vías del huésped para su beneficio. A su vez, las células huésped se resisten a eso empleando varias estrategias. Una de esas estrategias es la PANoptosis, que las células huésped utilizan como estrategia antiviral contra las infecciones por virus. Sin embargo, virus como IAV han desarrollado sus propias estrategias para contrarrestar la PANoptosis y explotarla en su beneficio 1,3,6.<...

El virus de la influenza A (IAV) es el miembro prototípico de la familia Orthomyxoviridae y se sabe que causa epidemias globales y pandemias impredecibles. IAV causa enfermedad respiratoria humana, gripe, comúnmente conocida como "gripe". La gripe es una enfermedad aguda que resulta en la inducción de respuestas inmunes innatas pro y antiinflamatorias del huésped y la muerte de las células epiteliales en el tracto respiratorio humano. Ambos procesos están gobernados por un fenómeno llamado muerte celular programada1. La señalización para la muerte celular programada se induce tan pronto como varios receptores de reconocimiento de patógenos detectan las partículas de virus entrantes en las células huésped. Esto conduce a la programación de la muerte de las células infectadas y la señalización a las células sanas vecinas por tres vías interconectadas llamadas piroptosis, apoptosis y necroptosis, recientemente acuñadas como un proceso, PANoptosis1.
La PANoptosis implica el procesamiento proteolítico de muchas proteínas del huésped y virales desde la inducción hasta la ejecución. Tal procesamiento de proteínas está encabezado principalmente por una familia de proteasas de cisteína llamadas caspasas 1,2. Se conocen hasta 18 caspasas (de caspasa 1 a caspasa 18)3. La mayoría de las caspasas se expresan como pro-caspasas y se activan al someterse a su propio procesamiento proteolítico, ya sea por autocatálisis u otras caspasas4 en respuesta a un estímulo como una infección viral. Se pensaba que la PANoptosis de las células infectadas por IAV era un mecanismo de defensa del huésped, pero IAV ha desarrollado formas de evadirlo y explotarlo para facilitar su replicación 1,2,5,6. Uno de ellos es antagonizar los factores del huésped a través de la escisión o degradación mediada por caspasa que son inherentemente antivirales o interfieren con uno de los pasos del ciclo de vida del IAV. Con este fin, se ha descubierto que los factores del huésped, cortactina, HDAC4 y HDAC6 sufren escisión o degradación mediada por caspasa en células epiteliales infectadas por IAV 7,8,9. El HDAC4 y el HDAC6 son factores anti-IAV 8,10, y la cortactina interfiere con la replicación del IAV en una etapa posterior de la infección, potencialmente durante el ensamblaje viral y la gemación11.
Además, también se activan varias caspasas, que, a su vez, escinden múltiples proteínas para activar la respuesta inflamatoria del huésped durante la infección por IAV 1,2. Además, la nucleoproteína (NP), la proteína M2 del canal iónico de IAV 12,13,14 y varias proteínas de otros virus 3,15,16 también sufren escisión mediada por caspasa durante la infección, lo que influye en la patogénesis viral. Por lo tanto, existe una necesidad continua de estudiar la escisión mediada por caspasa o la degradación de las proteínas del huésped y virales durante el IAV y otras infecciones virales para comprender las bases moleculares de la patogénesis viral. En este documento, los métodos se presentan para (1) evaluar la escisión o degradación de dichas proteínas por caspasas, (2) identificar esas caspasas, y (3) localizar los sitios de escisión.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A549 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRM-CCL-185</td>
			<td>Human, epithelial, lung</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspase 3 Inhibitor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>264156-M</td>
			<td>Also known as &#39;InSolution Caspase-3 Inhibitor II - Calbiochem&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-NP antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gift from Richard Webby (St Jude Children&#8217;s Research Hospital, Memphis, USA) to MH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13778150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDCK cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-34</td>
			<td>Dog, epithelial, kidney</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MG132</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium (MEM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11095080</td>
			<td>Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MISSION siRNA Universal Negative Control #1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SIC001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2&#160;</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td></td>
			<td>Odyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>50728</td>
			<td>Gift from Kenneth Yamada to Addgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NM_004346</td>
			<td>siRNA ID: SASI_Hs01_00139105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-designed small interferring RNA to caspase 6</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NM_001226</td>
			<td>siRNA ID: SASI_Hs01_00019062</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-designed small interferring RNA to caspase 7</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NM_001227</td>
			<td>siRNA ID: SASI_Hs01_00128361</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairs</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>KSPQ12012</td>
			<td>Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protran Premium nitrocellulose membrane</td>
			<td>Cytiva (Fomerly GE Healthcare)</td>
			<td>10600003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-actin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-cortactin antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFP antibody</td>
			<td>Takara</td>
			<td>632592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeeBlue Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC5625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection medium, Opti-MEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, TPCK-Treated</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>4370285</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying caspases and their motifs that cleave proteins during influenza a virus infection

Las caspasas, una familia de proteasas de cisteína, orquestan la muerte celular programada en respuesta a diversos estímulos, incluidas las infecciones microbianas. Inicialmente descrito como que ocurre por apoptosis, ahora se sabe que la muerte celular programada abarca tres vías interconectadas: piroptosis, apoptosis y necroptosis, acuñadas juntas como un proceso, PANoptosis. La infección por el virus Influence A (IAV) induce PANoptosis en células de mamíferos al inducir la activación de diferentes caspasas, que, a su vez, escinden varias proteínas del huésped y virales, lo que lleva a procesos como la activación de la respuesta antiviral innata del huésped o la degradación de proteínas antagónicas del huésped. En este sentido, se ha descubierto escisión mediada por caspasa 3 de la cortactina del huésped, la histona desacetilasa 4 (HDAC4) y la histona desacetilasa 6 (HDAC6) en células epiteliales animales y humanas en respuesta a la infección por IAV. Para demostrarlo, se emplearon inhibidores, interferencia de ARN y mutagénesis dirigida al sitio y, posteriormente, se midió la escisión o resistencia a la escisión y la recuperación de los polipéptidos cortactina, HDAC4 y HDAC6 mediante western blotting. Estos métodos, junto con RT-qPCR, forman una estrategia simple pero efectiva para identificar el huésped, así como las proteínas virales que experimentan escisión mediada por caspasa durante una infección de IAV u otros virus humanos y animales. En el presente protocolo se elaboran los resultados representativos de esta estrategia, y también se examinan las formas de hacerla más eficaz.

Tratamiento con inhibidor de caspasa 3 Se ha descubierto que los polipéptidos cortactina del huésped, HDAC4 y HDAC6 sufren degradación en respuesta a la infección por IAV tanto en células caninas (MDCK) como humanas (A549, NHBE) 7,8,9. Mediante el uso de los enfoques anteriores, se descubrió que las caspasas del huésped inducidas por IAV, particularmente la caspasa 3, causan su ...

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Identifying Caspases and their Motifs that Cleave Proteins During Influenza A Virus Infection

La infección por el virus de la influenza A (IAV) activa las caspasas que escinden las proteínas del huésped y virales, que, a su vez, tienen funciones pro y antivirales. Mediante el empleo de inhibidores, interferencia de ARN, mutagénesis dirigida al sitio y técnicas de Western blotting y RT-qPCR, se identificaron caspasas en células de mamíferos infectadas que escinden cortactina del huésped e histonas desacetilasas.

Identificación de caspasas y sus motivos que escinden proteínas durante la infección por el virus de la influenza A

Caspases, a family of cysteine proteases, orchestrate programmed cell death in response to various stimuli, including microbial infections. Initially ...

Este método ayudará a determinar y confirmar si una proteína en las células infectadas por el virus de la influenza sufre degradación o escisión por caspasas e identificar los sitios de escisión de caspasas. Este método requiere solo entornos básicos de laboratorio de biología molecular y celular y habilidades de investigación y no requiere ningún equipo especializado o capacitación en software. Este método se puede adaptar para lograr objetivos similares que implican la infección con otros virus o microbios animales, y la exposición a estímulos externos, como toxinas y productos químicos.Para comenzar, siembre células MDCK o A549 en una placa de cultivo celular de 12 pocillos. Incubar las células durante la noche a 37 grados centígrados bajo una atmósfera de dióxido de carbono al 5%. Al día siguiente, retire el medio de cultivo viejo de las células y lave las células en cada pocillo dos veces con un mililitro de MEM sin suero.Luego, infecte las células agregando 400 microlitros de inóculo del virus de la influenza A y coloque la placa para la incubación durante una hora. Después de la incubación, retire el inóculo del virus y lave las células con MEM. Agregue un mililitro de MEM sin suero a cada pocillo e incube las células como se muestra en el paso anterior.Después de 24 horas, cosecha las células raspándolas con un émbolo de jeringa de un mililitro y transfiérelas a un tubo de 1,5 mililitros. Centrifugar el tubo a 12, 000G durante dos minutos a temperatura ambiente y recoger el sobrenadante. Lave el pellet celular con 250 microlitros de solución salina tamponada con fosfato y centrífuga.Retire el sobrenadante y agregue 100 microlitros de tampón de lisis celular. Mezclar por vórtice. Caliente el tubo a 98 grados centígrados durante 10 minutos para lisar completamente las células.Luego, resuelva cantidades iguales de proteína de muestras no infectadas e infectadas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS estándar. Después de la electroforesis, transfiera el gel de proteína a una membrana de nitrocelulosa o PVDF y realice Western blotting. Compare los niveles de proteína en los carriles de muestra infectados tratados con simulacros y tratados con inhibidores.En 100 microlitros de medio apropiado, como Opti-MEM, diluir 100 nanomolares de control o caspasa siRNA, o volumen apropiado de reactivo de transfección. Incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente. Mezclar 100 microlitros de cada solución de ARNip con 100 microlitros de solución de reactivo de transfección e incubar durante 20 a 45 minutos a temperatura ambiente.Divida y agregue 100, 000 células MDCK o A549 en 800 microlitros del medio de crecimiento completo. Agregue 200 microlitros de complejo de reactivos de transfección de ARNip y agregue esta suspensión a una placa de cultivo de 12 pocillos. Incubar las células a 37 grados centígrados bajo una atmósfera de dióxido de carbono al 5% durante 72 horas.Infectar las células con el virus de la influenza A, pero sin inhibidores. Realice Western blot y compare los niveles de proteína como se mostró anteriormente. Localice los motivos de escisión de caspasa XXXD y DXXD en el polipéptido.Mutar el ácido aspártico P1, dos ácidos glutámicos o alanina por mutagénesis dirigida al sitio y confirmar mediante secuenciación de ADN. En 100 microlitros de un medio apropiado, diluir dos microgramos de ADN plasmático de tipo salvaje o mutante o volumen recomendado del reactivo de transfección e incubar los tubos durante cinco minutos a temperatura ambiente. Mezclar 100 microlitros de solución de ADN plasmático con 100 microlitros de la solución de reactivo de transfección e incubar durante 20 a 45 minutos a temperatura ambiente.Mientras tanto, divida y agregue 300, 000 células MDCK o A549 a 800 microlitros de medio de crecimiento completo. Agregue 200 microlitros de complejo de reactivo de transfección de ADN y agregue esta suspensión a una placa de cultivo de 12 pocillos. Incubar la placa a 37 grados centígrados bajo una atmósfera de dióxido de carbono al 5%.Después de 48 horas, infecte las células con el virus de la influenza A sin inhibidores. Realice Western blot y compare los niveles de proteína como se mostró anteriormente. Usando Western blotting, se evaluó la degradación de la cortactina del huésped por caspasas del huésped inducidas por la influenza.El tratamiento de las células infectadas por el virus de la influenza con un inhibidor de la caspasa-3 resultó en el rescate de la cortactina y la degradación viral de la NP. La cuantificación de la intensidad de las bandas de cortactina y su normalización con la banda de actina correspondiente mostró que el nivel de cortactina en las células infectadas tratadas con inhibidores de caspasa-3 era mayor en comparación con las células infectadas no tratadas. En células agotadas de caspasa-6 o caspasa-7.No se observó una recuperación significativa en los niveles de polipéptido cortactina, mientras que en las células agotadas en caspasa-3, la cortactina se recuperó de la degradación inducida por el virus de la gripe. La cuantificación y comparación de los niveles de polipéptidos mostró que el nivel de polipéptido de cortactina en células infectadas con expresión de caspasa-3 agotada fue mayor que las células con expresión normal de caspasa-3. La mutación del ácido aspártico en la posición 116 a ácido glutámico hizo que el polipéptido cortactina fuera resistente a la degradación inducida por el virus de la gripe.La cuantificación y comparación de los niveles de polipéptidos mostró que el nivel de polipéptido de cortactina mutante en las células infectadas era mayor que el del polipéptido de cortactina de tipo salvaje. Se requiere generar decenas de mutantes y realizar Western blot repetido para identificar el sitio de escisión de la caspasa en el polipéptido. Se podría desarrollar un ensayo bioquímico in vitro que contenga caspasa purificada y polipéptido objetivo para confirmar que la proteína de interés es un sustrato directo a base de gas.Este protocolo ayudará a comprender la importancia, la degradación o la escisión de la proteína diana en el sistema que se está estudiando, como una infección por virus o una enfermedad.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Generación de recombinantes del virus de influenza a partir del ADN plásmido

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Investigación

Inmunología e Infección

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Utilizando imágenes bioluminiscentes encargado de investigar la sinergia entre Streptococcus pneumoniae Y el Virus de la Influenza en ratones lactantes

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

De alto rendimiento Método de detección de virus de la influenza

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners

La identificación basada en péptidos de motivos funcionales y sus parejas de unión

Specific short  peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1  Nef, not only retain their biological function, but can ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Propagación del virus de la influenza en embrionados de pollo Huevos

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Co-inmunoprecipitación de la proteína de ratón Mx1 con la Influenza A nucleoproteína del virus

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Nasal Toallitas para Influenza A Detección de Virus y aislamiento de los cerdos

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Aislamiento de neutrófilos y análisis para determinar su papel en el linfoma de células sensibles a los agentes terapéuticos

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro El desmontaje de virus de influenza A cápsides por centrifugación en gradiente

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

La neuraminidasa Ensayo de inhibición basado en la fluorescencia para evaluar la susceptibilidad de los virus de la influenza a El Inhibidor de la neuraminidasa clase de antivirales

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...