Name: identifying caspases and their motifs that cleave proteins during influenza a virus infection
Uploaded: 2022-07-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identifying Caspases and their Motifs that Cleave Proteins During Influenza A Virus Infection at JoVE.com

Yazar, Jennifer Tipper, Bilan Li, Jesse vanWestrienen, Kevin Harrod, Da-Yuan Chen, Farjana Ahmed, Sonya Mros, Kenneth Yamada, Richard Webby, BEI Kaynakları (NIAID), Yeni Zelanda Sağlık Araştırma Konseyi, Maurice ve Phyllis Paykel Vakfı (Yeni Zelanda), HS ve J.C. Anderson Trust (Dunedin) ve Mikrobiyoloji ve İmmünoloji Bölümü ve Biyomedikal Bilimler Okulu'nu (Otago Üniversitesi) kabul ediyor.

IAV ve memeli hücreleriyle çalışmak için Otago Üniversitesi Kurumsal Biyolojik Güvenlik Komitesi'nden düzenleyici onaylar alındı. Bu çalışmada Madin-Darby Köpek Böbreği (MDCK) veya insan akciğer alveoler epitel A549 hücreleri ve IAV H1N1 alt tipleri kullanılmıştır. IAV, başka bir yerde açıklandığı gibi tavuk yumurtasında yetiştirildi17. Memeli hücreleriyle çalışmak için steril ve aseptik koşullar kullanıldı ve IAV alt tipleriyle çalışmak için bir Biyogüve...

<ol>
	<li>Place, D. E., Lee, S., Kanneganti, T. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PANoptosis+in+microbial+infection.">PANoptosis in microbial infection.</a> Current Opinion in Microbiology. 59, 42-49 (2021).</li><li>Zheng, M., Kanneganti, T. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+the+ZBP1-NLRP3+inflammasome+and+its+implications+in+pyroptosis,+apoptosis,+and+necroptosis+(PANoptosis).">The regulation of the ZBP1-NLRP3 inflammasome and its implications in pyroptosis, apoptosis, and necroptosis (PANoptosis).</a> Immunological Reviews. 297 (1), 26-38 (2020).</li><li>Connolly, P. F., Fearnhead, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+hijacking+of+host+caspases:+An+emerging+category+of+pathogen-host+interactions.">Viral hijacking of host caspases: An emerging category of pathogen-host interactions.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 24 (8), 1401-1410 (2017).</li><li>Julien, O., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspases+and+their+substrates.">Caspases and their substrates.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 24 (8), 1380-1389 (2017).</li><li>Balachandran, S., Rall, G. F., Gack, M. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benefits+and+perils+of+necroptosis+in+influenza+virus+infection.">Benefits and perils of necroptosis in influenza virus infection.</a> Journal of Virology. 94 (9), 01101-01119 (2020).</li><li>Ampomah, P. B., Lim, L. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+A+virus-induced+apoptosis+and+virus+propagation.">Influenza A virus-induced apoptosis and virus propagation.</a> Apoptosis. 25 (1-2), 1-11 (2020).</li><li>Chen, D. Y., Husain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-mediated+degradation+of+host+cortactin+that+promotes+influenza+A+virus+infection+in+epithelial+cells.">Caspase-mediated degradation of host cortactin that promotes influenza A virus infection in epithelial cells.</a> Virology. 497, 146-156 (2016).</li><li>Galvin, H. D., Husain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+A+virus-induced+host+caspase+and+viral+PA-X+antagonize+the+antiviral+host+factor,+histone+deacetylase+4.">Influenza A virus-induced host caspase and viral PA-X antagonize the antiviral host factor, histone deacetylase 4.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (52), 20207-20221 (2019).</li><li>Husain, M., Harrod, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+A+virus-induced+caspase-3+cleaves+the+histone+deacetylase+6+in+infected+epithelial+cells.">Influenza A virus-induced caspase-3 cleaves the histone deacetylase 6 in infected epithelial cells.</a> FEBS Letters. 583 (15), 2517-2520 (2009).</li><li>Husain, M., Cheung, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+6+inhibits+influenza+A+virus+release+by+downregulating+the+trafficking+of+viral+components+to+the+plasma+membrane+via+its+substrate,+acetylated+microtubules.">Histone deacetylase 6 inhibits influenza A virus release by downregulating the trafficking of viral components to the plasma membrane via its substrate, acetylated microtubules.</a> Journal of Virology. 88 (19), 11229-11239 (2014).</li><li>Chen, D. Y., Husain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-mediated+cleavage+of+human+cortactin+during+influenza+A+virus+infection+occurs+in+its+actin-binding+domains+and+is+associated+with+released+virus+titres.">Caspase-mediated cleavage of human cortactin during influenza A virus infection occurs in its actin-binding domains and is associated with released virus titres.</a> Viruses. 12 (1), 87 (2020).</li><li>Zhirnov, O. P., Syrtzev, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+pathogenicity+is+determined+by+caspase+cleavage+motifs+located+in+the+viral+proteins.">Influenza virus pathogenicity is determined by caspase cleavage motifs located in the viral proteins.</a> Journal of Molecular and Genetic Medicine. 3 (1), 124-132 (2009).</li><li>Zhirnov, O. P., Klenk, H. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+caspase+cleavage+motifs+of+NP+and+M2+proteins+attenuate+virulence+of+a+highly+pathogenic+avian+influenza+virus.">Alterations in caspase cleavage motifs of NP and M2 proteins attenuate virulence of a highly pathogenic avian influenza virus.</a> Virology. 394 (1), 57-63 (2009).</li><li>Zhirnov, O. P., Konakova, T. E., Garten, W., Klenk, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-dependent+N-terminal+cleavage+of+influenza+virus+nucleocapsid+protein+in+infected+cells.">Caspase-dependent N-terminal cleavage of influenza virus nucleocapsid protein in infected cells.</a> Journal of Virology. 73 (12), 10158-10163 (1999).</li><li>Robinson, B. A., Van Winkle, J. A., McCune, B. T., Peters, A. M., Nice, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-mediated+cleavage+of+murine+norovirus+NS1/2+potentiates+apoptosis+and+is+required+for+persistent+infection+of+intestinal+epithelial+cells.">Caspase-mediated cleavage of murine norovirus NS1/2 potentiates apoptosis and is required for persistent infection of intestinal epithelial cells.</a> PLOS Pathogens. 15 (7), 1007940 (2019).</li><li>Richard, A., Tulasne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+cleavage+of+viral+proteins,+another+way+for+viruses+to+make+the+best+of+apoptosis.">Caspase cleavage of viral proteins, another way for viruses to make the best of apoptosis.</a> Cell Death &amp; Disease. 3 (3), 277 (2012).</li><li>Brauer, R., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+propagation+in+embryonated+chicken+eggs.">Influenza virus propagation in embryonated chicken eggs.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), e52421 (2015).</li><li>L&#252;thi, A. U., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CASBAH:+A+searchable+database+of+caspase+substrates.">The CASBAH: A searchable database of caspase substrates.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 14 (4), 641-650 (2007).</li><li>Kumar, S., van Raam, B. J., Salvesen, G. S., Cieplak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+cleavage+sites+in+the+human+proteome:+CaspDB,+a+database+of+predicted+substrates.">Caspase cleavage sites in the human proteome: CaspDB, a database of predicted substrates.</a> PLoS One. 9 (10), 110539 (2014).</li><li>Igarashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CutDB:+A+proteolytic+event+database.">CutDB: A proteolytic event database.</a> Nucleic Acids Research. 35 (Database issue). 35, 546-549 (2007).</li><li>Crawford, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DegraBase:+A+database+of+proteolysis+in+healthy+and+apoptotic+human+cells.">The DegraBase: A database of proteolysis in healthy and apoptotic human cells.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 12 (3), 813-824 (2013).</li><li>Rawlings, N. D., Tolle, D. P., Barrett, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEROPS:+The+peptidase+database.">MEROPS: The peptidase database.</a> Nucleic Acids Research. 32, 160-164 (2004).</li><li>Lange, P. F., Overall, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopFIND,+a+knowledgebase+linking+protein+termini+with+function.">TopFIND, a knowledgebase linking protein termini with function.</a> Nature Methods. 8 (9), 703-704 (2011).</li><li>Fortelny, N., Yang, S., Pavlidis, P., Lange, P. F., Overall, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+TopFIND+3.0+with+TopFINDer+and+PathFINDer:+Database+and+analysis+tools+for+the+association+of+protein+termini+to+pre-+and+post-translational+events.">Proteome TopFIND 3.0 with TopFINDer and PathFINDer: Database and analysis tools for the association of protein termini to pre- and post-translational events.</a> Nucleic Acids Research. 43, 290-297 (2015).</li></ol>

Virüslerin konakçı faktörleri ve yolları kendi yararlarına göre uyarladıkları tespit edilmiştir. Buna karşılık, konakçı hücreler çeşitli stratejiler kullanarak buna direnirler. Bu stratejilerden biri, konakçı hücrelerin virüs enfeksiyonlarına karşı antiviral bir strateji olarak kullandıkları PANoptozdur. Bununla birlikte, IAV gibi virüsler, PANoptoza karşı koymak ve onu kendi avantajlarına göre kullanmak için kendi stratejilerini geliştirmiştir ...

İnfluenza A virüsü (IAV), Orthomyxoviridae ailesinin prototipik üyesidir ve küresel salgınlara ve öngörülemeyen pandemilere neden olduğu bilinmektedir. IAV, genellikle "grip" olarak bilinen insan solunum yolu hastalığına, influenzaya neden olur. Grip, konakçı pro- ve anti-inflamatuar doğuştan gelen immün yanıtların indüksiyonu ve insan solunum yollarında epitel hücrelerinin ölümü ile sonuçlanan akut bir hastalıktır. Her iki süreç de programlanmış hücre ölümü1 adı verilen bir fenomen tarafından yönetilir. Programlanmış hücre ölümü için sinyalizasyon, çeşitli patojen tanıma reseptörleri konakçı hücrelerde gelen virüs parçacıklarını algıladığı anda indüklenir. Bu, enfekte olmuş hücrelerin ölümünün programlanmasına ve komşu sağlıklı hücrelere, pirotoz, apoptoz ve nekroptoz adı verilen birbirine bağlı üç yolla sinyal verilmesine yol açar - son zamanlarda tek bir süreç olarak adlandırılan PANoptoz1.
PANoptoz, indüksiyondan uygulamaya kadar birçok konakçı ve viral proteinin proteolitik olarak işlenmesini içerir. Proteinlerin bu şekilde işlenmesine öncelikle kaspazlar 1,2 adı verilen bir sistein proteaz ailesi öncülük eder. 18'e kadar kaspaz (kaspaz 1'den kaspaz 18'e)3 olarak bilinir. Çoğu kaspaz pro-kaspaz olarak ifade edilir ve virüs enfeksiyonu gibi bir uyarana yanıt olarak otokataliz veya diğer kaspazlar4 ile kendi proteolitik işlemlerinden geçirilerek aktive edilir. IAV ile enfekte olmuş hücrelerin PANoptozunun bir konakçı savunma mekanizması olduğu düşünülüyordu, ancak IAV, replikasyonunu kolaylaştırmak için ondan kaçınmanın ve yararlanmanın yollarını geliştirdi 1,2,5,6. Bunlardan biri, konakçı faktörleri, doğal olarak antiviral olan veya IAV yaşam döngüsünün adımlarından birine müdahale eden kaspaz aracılı bölünme veya bozunma yoluyla antagonize etmektir. Bu amaçla, konakçı faktörler, kortaktin, HDAC4 ve HDAC6'nın IAV ile enfekte epitel hücrelerinde kaspaz aracılı bölünme veya bozulmaya uğradığı keşfedilmiştir 7,8,9. HDAC4 ve HDAC6, anti-IAV faktörleri 8,10'dur ve kortaktin, enfeksiyonun sonraki bir aşamasında, potansiyel olarak viral montaj ve tomurcuklanma sırasında IAV replikasyonuna müdahale eder 11.
Ek olarak, çeşitli kaspazlar da aktive edilir, bu da IAV enfeksiyonu 1,2 sırasında konakçı enflamatuar yanıtını aktive etmek için birden fazla proteini parçalar. Ayrıca, nükleoprotein (NP), IAV 12,13,14'ün iyon kanallı M2 proteini ve diğer virüslerin çeşitli proteinleri 3,15,16 da enfeksiyon sırasında kaspaz aracılı bölünmeye uğrar ve bu da viral patogenezi etkiler. Bu nedenle, viral patogenezin moleküler temelini anlamak için IAV ve diğer virüs enfeksiyonları sırasında konakçı ve viral proteinlerin kaspaz aracılı bölünmesini veya parçalanmasını incelemeye sürekli ihtiyaç vardır. Burada, yöntemler (1) bu tür proteinlerin kaspazlar tarafından bölünmesini veya parçalanmasını değerlendirmek, (2) bu kaspazları tanımlamak ve (3) bölünme bölgelerini bulmak için sunulmuştur.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A549 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRM-CCL-185</td>
			<td>Human, epithelial, lung</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspase 3 Inhibitor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>264156-M</td>
			<td>Also known as &#39;InSolution Caspase-3 Inhibitor II - Calbiochem&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-NP antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gift from Richard Webby (St Jude Children&#8217;s Research Hospital, Memphis, USA) to MH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13778150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDCK cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-34</td>
			<td>Dog, epithelial, kidney</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MG132</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium (MEM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11095080</td>
			<td>Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MISSION siRNA Universal Negative Control #1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SIC001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2&#160;</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td></td>
			<td>Odyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>50728</td>
			<td>Gift from Kenneth Yamada to Addgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NM_004346</td>
			<td>siRNA ID: SASI_Hs01_00139105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-designed small interferring RNA to caspase 6</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NM_001226</td>
			<td>siRNA ID: SASI_Hs01_00019062</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-designed small interferring RNA to caspase 7</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NM_001227</td>
			<td>siRNA ID: SASI_Hs01_00128361</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairs</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>KSPQ12012</td>
			<td>Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protran Premium nitrocellulose membrane</td>
			<td>Cytiva (Fomerly GE Healthcare)</td>
			<td>10600003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-actin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-cortactin antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFP antibody</td>
			<td>Takara</td>
			<td>632592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeeBlue Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC5625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection medium, Opti-MEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, TPCK-Treated</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>4370285</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying caspases and their motifs that cleave proteins during influenza a virus infection

Sistein proteazlarının bir ailesi olan kaspazlar, mikrobiyal enfeksiyonlar da dahil olmak üzere çeşitli uyaranlara yanıt olarak programlanmış hücre ölümünü düzenler. Başlangıçta apoptoz ile ortaya çıktığı tanımlanan programlanmış hücre ölümünün şimdi birbirine bağlı üç yolu kapsadığı bilinmektedir: pirotoz, apoptoz ve nekroptoz, birlikte tek bir süreç olarak adlandırılan PANoptoz. Etki Bir virüs (IAV) enfeksiyonu, farklı kaspazların aktivasyonunu indükleyerek memeli hücrelerinde PANoptozu indükler, bu da çeşitli konakçıların yanı sıra viral proteinleri de parçalara ayırır ve konakçının doğuştan gelen antiviral yanıtının aktivasyonu veya antagonistik konakçı proteinlerinin bozulması gibi süreçlere yol açar. Bu bağlamda, IAV enfeksiyonuna yanıt olarak hem hayvan hem de insan epitel hücrelerinde konakçı kortaktin, histon deasetilaz 4 (HDAC4) ve histon deasetilaz 6'nın (HDAC6) kaspaz 3 aracılı bölünmesi keşfedilmiştir. Bunu göstermek için, inhibitörler, RNA girişimi ve bölgeye yönelik mutagenez kullanıldı ve daha sonra, bölünmeye karşı bölünme veya direnç ve kortaktin, HDAC4 ve HDAC6 polipeptitlerinin geri kazanımı batı lekelenmesi ile ölçüldü. Bu yöntemler, RT-qPCR ile birlikte, IAV veya diğer insan ve hayvan virüslerinin enfeksiyonu sırasında kaspaz aracılı bölünmeye maruz kalan viral proteinlerin yanı sıra konakçıyı tanımlamak için basit ama etkili bir strateji oluşturur. Mevcut protokol, bu stratejinin temsili sonuçlarını detaylandırmakta ve daha etkili hale getirmenin yolları da tartışılmaktadır.

Kaspaz 3 inhibitörü ile tedavi Konakçı kortaktin, HDAC4 ve HDAC6 polipeptitlerinin hem köpek (MDCK) hem de insan (A549, NHBE) hücrelerinde IAV enfeksiyonuna yanıt olarak bozulmaya uğradığı keşfedilmiştir 7,8,9. Yukarıdaki yaklaşımlar kullanılarak, IAV kaynaklı konak kaspazlarının, özellikle kaspaz 3'ün, 7,8,9<sup class...

Watch this Scientific Journal Video about Identifying Caspases and their Motifs that Cleave Proteins During Influenza A Virus Infection at JoVE.com

Identifying Caspases and their Motifs that Cleave Proteins During Influenza A Virus Infection

İnfluenza A virüsü (IAV) enfeksiyonu, konakçı ve viral proteinleri parçalayan kaspazları aktive eder ve bunlar da pro- ve antiviral fonksiyonlara sahiptir. İnhibitörler, RNA girişimi, bölgeye yönelik mutagenez ve batı lekelenme ve RT-qPCR teknikleri kullanılarak, konakçı kortaktin ve histon deasetilazları parçalayan enfekte memeli hücrelerinde kaspazlar tanımlandı.

İnfluenza A Virüsü Enfeksiyonu Sırasında Proteinleri Parçalayan Kaspasların ve Motiflerinin Belirlenmesi

Caspases, a family of cysteine proteases, orchestrate programmed cell death in response to various stimuli, including microbial infections. Initially ...

Bu yöntem, influenza virüsü ile enfekte olmuş hücrelerdeki bir proteinin kaspazlar tarafından bozulmaya veya bölünmeye uğrayıp uğramadığını belirlemeye ve doğrulamaya ve kaspaz bölünme bölgelerini tanımlamaya yardımcı olacaktır. Bu yöntem sadece temel moleküler ve hücresel biyoloji laboratuvar ortamlarını ve araştırma becerilerini gerektirir ve herhangi bir özel ekipman veya yazılım eğitimi gerektirmez. Bu yöntem, diğer hayvan virüsleri veya mikropları ile enfeksiyonu ve toksinler ve kimyasallar gibi dış uyaranlara maruz kalmayı içeren benzer hedeflere ulaşmak için uyarlanabilir.Başlamak için, 12 kuyucuklu bir hücre kültürü plakasında MDCK veya A549 hücrelerini tohumlayın. Hücreleri% 5'lik bir karbondioksit atmosferi altında gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, eski kültür ortamını hücrelerden çıkarın ve her bir kuyucuktaki hücreleri bir mililitre serumsuz MEM ile iki kez yıkayın.Daha sonra, 400 mikrolitre influenza A virüsü inokülü ekleyerek hücreleri enfekte edin ve plakayı bir saat boyunca inkübasyon için yerleştirin. Kuluçkadan sonra, virüs inokulumunu çıkarın ve hücreleri MEM ile yıkayın. Her bir kuyucuğa bir mililitre serumsuz MEM ekleyin ve hücreleri önceki adımda gösterildiği gibi inkübe edin.24 saat sonra, hücreleri bir mililitrelik bir şırınga pistonuyla kazıyarak toplayın ve 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Tüpü oda sıcaklığında iki dakika boyunca 12.000G'de santrifüj yapın ve süpernatanı toplayın. Hücre peletini 250 mikrolitre fosfat tamponlu salin ve santrifüj ile yıkayın.Süpernatantı çıkarın ve 100 mikrolitre hücre lizis tamponu ekleyin. Girdap ile karıştırın. Hücreleri tamamen lize etmek için tüpü 98 santigrat derecede 10 dakika ısıtın.Daha sonra, enfekte olmamış ve enfekte olmuş numunelerden eşit miktarda proteini standart SDS poliakrilamid jel elektroforezi ile çözün. Elektroforezden sonra, protein jelini bir nitroselüloz veya PVDF membranına aktarın ve Batı lekelemesi yapın. Alay ile tedavi edilmiş ve inhibitör ile muamele edilmiş enfekte numune şeritlerindeki protein seviyelerini karşılaştırın.Opti-MEM gibi 100 mikrolitre uygun ortamda, 100 nanomolar kontrol veya kaspaz siRNA veya uygun hacimde transfeksiyon reaktifi seyreltin. Oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Her siRNA çözeltisinin 100 mikrolitresini 100 mikrolitre transfeksiyon reaktif çözeltisi ile karıştırın ve oda sıcaklığında 20 ila 45 dakika inkübe edin.Tam büyüme ortamının 800 mikrolitresine 100.000 MDCK veya A549 hücresini bölün ve ekleyin. 200 mikrolitre siRNA transfeksiyon reaktif kompleksi ekleyin ve bu süspansiyonu 12 delikli bir kültür plakasına ekleyin. Hücreleri 72 saat boyunca% 5'lik bir karbondioksit atmosferi altında 37 santigrat derecede inkübe edin.Hücreleri influenza A virüsü ile enfekte edin, ancak inhibitörler olmadan. Batı lekelemesi yapın ve daha önce gösterildiği gibi protein seviyelerini karşılaştırın. Polipeptit üzerindeki XXXD ve DXXD kaspaz bölünme motiflerini bulun.P1 aspartik asidi, iki glutamik asidi veya alanini bölgeye yönelik mutagenez ile mutasyona uğratın ve DNA dizilimi ile onaylayın. Uygun bir ortamın 100 mikrolitresinde, iki mikrogram vahşi tip veya mutant plazma DNA'sını veya transfeksiyon reaktifinin önerilen hacmini seyreltin ve tüpleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin. 100 mikrolitre plazma DNA çözeltisini 100 mikrolitre transfeksiyon reaktif çözeltisi ile karıştırın ve oda sıcaklığında 20 ila 45 dakika inkübe edin.Bu arada, 800 mikrolitre tam büyüme ortamına 300.000 MDCK veya A549 hücresini bölün ve ekleyin. 200 mikrolitre DNA transfeksiyon reaktif kompleksi ekleyin ve bu süspansiyonu 12 delikli bir kültür plakasına ekleyin. Plakayı% 5'lik bir karbondioksit atmosferi altında 37 santigrat derecede inkübe edin.48 saat sonra, hücreleri inhibitörler olmadan influenza A virüsü ile enfekte edin. Batı lekelemesi yapın ve daha önce gösterildiği gibi protein seviyelerini karşılaştırın. Western blotting kullanılarak, konakçı kortaktinin influenzaya bağlı konakçı kaspazları ile bozulması değerlendirildi.İnfluenza virüsü ile enfekte olmuş hücrelerin bir kaspaz-3 inhibitörü ile tedavisi, kortaktin ve viral NP yıkımının kurtarılmasıyla sonuçlandı. Kortaktin bantlarının yoğunluğunun ölçülmesi ve karşılık gelen aktin bandı ile normalizasyonu, kaspaz-3 inhibitörü ile tedavi edilen enfekte hücrelerdeki kortaktin seviyesinin, tedavi edilmemiş enfekte hücrelere kıyasla daha yüksek olduğunu göstermiştir. Kaspaz-6 veya kaspaz-7 tükenmiş hücrelerde.Kortaktin polipeptit düzeylerinde anlamlı bir iyileşme gözlenmezken, kaspaz-3 tükenmiş hücrelerde kortaktin, influenza virüsünün neden olduğu yıkımdan kurtuldu. Polipeptit düzeylerinin nicelleştirilmesi ve karşılaştırılması, tükenmiş kaspaz-3 ekspresyonuna sahip enfekte hücrelerde kortaktin polipeptit düzeyinin normal kaspaz-3 ekspresyonuna sahip hücrelerden daha yüksek olduğunu göstermiştir. Aspartik asidin 116 pozisyonunda glutamik aside mutasyonu, kortaktin polipeptitini influenza virüsünün neden olduğu bozunmaya dirençli hale getirmiştir.Polipeptit düzeylerinin nicelleştirilmesi ve karşılaştırılması, enfekte hücrelerde mutant kortaktin polipeptit düzeyinin vahşi tip kortaktin polipeptitinden daha yüksek olduğunu göstermiştir. Polipeptitteki kaspaz bölünme bölgesini tanımlamak için onlarca mutant üretmek ve tekrarlanan Batı lekelenmesi yapmak gerekir. Saflaştırılmış kaspaz ve hedef polipeptit içeren bir in vitro biyokimyasal tahlil, ilgilenilen proteinin doğrudan gaz bazlı bir substrat olduğunu doğrulamak için geliştirilebilir.Bu protokol, virüs enfeksiyonu veya bir hastalık gibi çalışılan sistemdeki hedef proteinin önemini, bozulmasını veya bölünmesini anlamaya yardımcı olacaktır.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Plazmid DNA Rekombinant Grip Virüsü Üretimi

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Yılları arasında sinerjistik Araştırma Bioluminescent Görüntüleme kullanma Streptococcus pneumoniae Bebek Fare ve İnfluenza A Virüsü

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Gribi için yüksek verimlilik Tespit Yöntemi

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners

Fonksiyonel Motifler ve Bağlama Ortaklar peptid bazlı Kimlik

Specific short  peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1  Nef, not only retain their biological function, but can ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Embriyone Tavuk Yumurta Grip Virüsü Yayılım

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

İnfluenza A virüsü nükleoproteini Fare MX1 Protein Co-immunopresipitasyonu

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Domuz influenza A virüs Algılama ve İzolasyonu için Burun Mendil

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Nötrofil İzolasyon ve Analiz Terapötik Ajanların için Lenfoma Hücre Duyarlılık kendi Rolü belirleme

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Gradient Santrifüj tarafından İnfluenza A Virüsü Kapsidlerin Vitro Demontaj içinde

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

Floresans tabanlı Nöraminidaz İnhibisyonu Tahlili antivirallerin nöraminidaz inhibitörü Class Nezle Virüslerinden eğilimi değerlendirilebilir

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...