Name: protocols for crispr/cas9 mutagenesis of the oriental fruit fly bactrocera dorsalis
Uploaded: 2022-09-28T12:40:00
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이 작업은 심천 과학 기술 프로그램 (보조금 번호. KQTD20180411143628272) 및 심천 Dapeng 신구의 과학 기술 혁신 및 산업 발전을위한 특별 기금 (보조금 번호. PT202101-02).

1. sgRNA의 표적 설계 및 시험관 내 합성
<ol><li>관심 표적 유전자의 구조를 예측하고 B. dorsalis 게놈의 생물 정보학 분석을 통해 엑손과 인트론 사이의 경계를 결정합니다 (여기에 사용 된 소프트웨어 응용 프로그램은 재료 표에 나열되어 있음). 참고: BLAT20 은 게놈에서 잠재적인 유전자 좌위를 검색하는 데 사용되었습니다. 고품질 RN...

<ol>
	<li>Christenson, L. D., Foote, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+fruit+flies.">Biology of fruit flies.</a> Annual Review of Entomology. 5 (1), 171-192 (1960).</li><li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+assessment+of+the+economic+losses+caused+by+Bactrocera+dorsalis,+B.+cucurbitae+and+B.+tau+to+Guangdong+province.">The assessment of the economic losses caused by Bactrocera dorsalis, B. cucurbitae and B. tau to Guangdong province.</a> Plant Quarantine. 27 (3), 50-56 (2013).</li><li>Jin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+control+measures+and+drug+resistance+management+of+Bactrocera+dorsalis.">Chemical control measures and drug resistance management of Bactrocera dorsalis.</a> Agrochemicals. 60 (1), 1-5 (2021).</li><li>Yang, B., Liu, Y., Wang, B., Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfaction-based+behaviorally+manipulated+technology+of+pest+insects:+research+progress,+opportunities+and+challenges.">Olfaction-based behaviorally manipulated technology of pest insects: research progress, opportunities and challenges.</a> Bulletin of National Natural Science Foundation of China. 34 (4), 441-446 (2020).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Garneau, J. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+toolkit+for+genome+editing+in+a+disease+vector,+Aedes+aegypti:+transgenic+lines+expressing+Cas9+and+single+guide+RNA+induce+efficient+mutagenesis.">Expanding the toolkit for genome editing in a disease vector, Aedes aegypti: transgenic lines expressing Cas9 and single guide RNA induce efficient mutagenesis.</a> The CRISPR Journal. 4 (6), 846-853 (2021).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+locusts:+Successful+establishment+of+an+olfactory+deficiency+line+by+targeting+the+mutagenesis+of+an+odorant+receptor+co-receptor+(Orco).">CRISPR/Cas9 in locusts: Successful establishment of an olfactory deficiency line by targeting the mutagenesis of an odorant receptor co-receptor (Orco).</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 27-35 (2016).</li><li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+the+Bombyx+mori+odorant+receptor+co-receptor+(BmOrco)+impairs+olfactory+sensitivity+in+silkworms.">Deletion of the Bombyx mori odorant receptor co-receptor (BmOrco) impairs olfactory sensitivity in silkworms.</a> Insect Biochemistry &amp; Molecular Biology. 86, 58-67 (2017).</li><li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+somatic+and+germline+genome+engineering+of+Bactrocera+dorsalis+by+the+CRISPR/Cas9+system.">Efficient somatic and germline genome engineering of Bactrocera dorsalis by the CRISPR/Cas9 system.</a> Pest Management Science. 75 (7), 1921-1932 (2019).</li><li>Bai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+knockout+of+the+eye+pigmentation+gene+white+leads+to+alterations+in+colour+of+head+spots+in+the+oriental+fruit+fly,+Bactrocera+dorsalis.">CRISPR/Cas9-mediated knockout of the eye pigmentation gene white leads to alterations in colour of head spots in the oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis.</a> Insect Molecular Biology. 28 (6), 837-849 (2019).</li><li>Zheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustered+regularly+interspaced+short+palindromic+repeats+(CRISPR)/CRISPR-associated+9-mediated+mutagenesis+of+the+multiple+edematous+wings+gene+induces+muscle+weakness+and+flightlessness+in+Bactrocera+dorsalis+(Diptera:+Tephritidae).">Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated 9-mediated mutagenesis of the multiple edematous wings gene induces muscle weakness and flightlessness in Bactrocera dorsalis (Diptera: Tephritidae).</a> Insect Molecular Biology. 28 (2), 222-234 (2019).</li><li>Kent, W. 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TransDecoder Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0">https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0</a> (2018)</li><li>Robinson, J. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+gene+deletion+and+replacement+using+the+CRISPR/Cas9+system+in+human+cells.">Precise gene deletion and replacement using the CRISPR/Cas9 system in human cells.</a> Biotechniques. 57 (3), 115-124 (2014).</li><li>Ren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rectal+bacteria+produce+sex+pheromones+in+the+male+oriental+fruit+fly.">Rectal bacteria produce sex pheromones in the male oriental fruit fly.</a> Current Biology. 31 (10), 2220-2226 (2021).</li><li>Xiao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+CRISPR/Cas9-based+gene+editing+in+HIV-1/AIDS+therapy.">Application of CRISPR/Cas9-based gene editing in HIV-1/AIDS therapy.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 9, 69 (2019).</li><li>El-Mounadi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles,+applications,+and+biosafety+of+plant+genome+editing+using+CRISPR-Cas9.">Principles, applications, and biosafety of plant genome editing using CRISPR-Cas9.</a> Frontiers in Plant Science. 11, 56 (2020).</li><li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering.">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).</li><li>Labun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHOPCHOP+v3:+expanding+the+CRISPR+web+toolbox+beyond+genome+editing.">CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing.</a> Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).</li><li>Ai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+microinjection+and+knockout+mutant+identification+of+CRISPR/Cas9+genome-edited+Helicoverpa+armigera+(H&#252;bner).">Embryo microinjection and knockout mutant identification of CRISPR/Cas9 genome-edited Helicoverpa armigera (H&#252;bner).</a> Journal of Visualized Experiments. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockout+of+juvenile+hormone+receptor,+Methoprene-tolerant,+induces+black+larval+phenotype+in+the+yellow+fever+mosquito,+Aedes+aegypti.">Knockout of juvenile hormone receptor, Methoprene-tolerant, induces black larval phenotype in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21501-21507 (2019).</li><li>Laohakieat, K., Isasawin, S., Thanaphum, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transformer-2+and+fruitless+characterisation+with+developmental+expression+profiles+of+sex-determining+genes+in+Bactrocera+dorsalis+and+B.+correcta.">The transformer-2 and fruitless characterisation with developmental expression profiles of sex-determining genes in Bactrocera dorsalis and B. correcta.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).</li><li>Gabrieli, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm-less+males+modulate+female+behaviour+in+Ceratitis+capitata+(Diptera:+Tephritidae).">Sperm-less males modulate female behaviour in Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae).</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 13-26 (2016).</li></ol>

CRISPR/Cas9 시스템은 가장 널리 사용되는 유전자 편집 도구이며 유전자 렙기(30), 작물 육종(31) 및 유전자 기능(32)의 기초 연구와 같은 다양한 응용 분야를 가지고 있습니다. 이 시스템은 이미 다양한 곤충 종의 유전자 편집에 적용되었으며 해충의 기능적 유전자 연구에 효과적인 도구로 사용되었습니다. 여기에서 제시하는 프로토콜은 가이드 RNA?...

동양 초파리인 박트로세라 등파리 는 구아바, 망고, 유지니아 종, 수리남 체리, 감귤류, 비파, 파파야1을 포함한 150종 이상의 과일 작물에 피해를 입히는 국제적인 해충 종입니다. 광둥성(중국)에서만 발생한 피해액은 2억 위안 이상으로 추산된다. 성체 암컷은 숙성 또는 익은 과일의 껍질 아래에 알을 삽입하여 과일의 부패와 이탈을 유발하여 과일의 품질과 작물의 전체 수확량을 감소시킵니다2. 성인 초파리는 비행 능력이 뛰어나고 유충이 과일 피부에 구멍을 뚫기 때문에 해충과 직접 접촉해야하는 살충제는 현장에서 제대로 작동하지 않습니다. 또한 살충제의 광범위한 사용으로 인해 다양한 농약에 대한 B. dorsalis 의 저항성이 증가하여 이러한 해로운 해충의 방제가 더욱 어려워졌습니다3. 따라서 효과적이고 환경 친화적 인 해충 관리 전략의 개발이 절실히 필요합니다.
최근 분자생물학적 도구와 고처리량 염기서열분석 기술의 발달로 과학자들은 다양한 해충의 중요한 유전자(분자 표적)의 기능을 표적으로 하는 RNAi와 같은 환경 친화적인 해충 관리 전략을 개발하려고 시도하고 있습니다. 해충의 생존과 번식에 중요한 유전자는 기능적 유전자 연구를 통해 확인할 수 있으며 특정 표적화되고 환경 친화적 인 해충 관리 도구4의 개선을위한 잠재적 인 분자 표적 역할을합니다. 이러한 전략을 동양 초파리 방제에 적용하려면 기능적 유전자 연구를위한 효과적인 방법이 필요합니다.
CRISPR/Cas(클러스터링된 규칙적인 간격의 짧은 회문 반복/CRISPR 관련) 엔도뉴클레아제 시스템은 박테리아와 고세균에서 처음 발견되었으며 박테리오파지 감염에 의해 도입된 것과 같은 외래 세포 내 DNA의 인식 및 분해에 관여하는 적응 메커니즘으로 밝혀졌습니다.5. 유형 II CRISPR 시스템에서 Cas9 엔도뉴클레아제는 작은 관련 RNA(crRNA 및 tracrRNA)에 의해 유도되어 침입 DNA 6,7,8을 절단하며 현재까지 유전자 편집에 가장 널리 사용되는 도구 중 하나가 되었습니다 9,10,11,12. CRISPR/Cas9 시스템은 유전자 침묵의 높은 효율과 저렴한 비용과 같은 몇 가지 장점을 가지고 있기 때문에 이미 Aedes aegypti13,14, Locusta migratoria15 및 Bombyx mori16을 포함한 다양한 곤충 종의 유전자 편집에 적용되었습니다. B. dorsalis에서 체색, 날개 이형성 및 성 결정과 관련된 유전자는 CRISPR / Cas917,18,19를 사용하여 성공적으로 녹아웃되었습니다. 그러나 이 곤충에 CRISPR/Cas9를 적용하기 위한 자세한 절차는 아직 불완전합니다. 또한 B. dorsalis 유전자 편집을 위해 연구자들이 제공하는 일부 단계도 다양하며 표준화가 필요합니다. 예를 들어, Cas9의 형태는 출판된 참고 문헌17,18,19에서 달랐습니다.
이 논문은 가이드 RNA의 설계 및 합성, 배아 수집, 배아 주입, 곤충 사육 및 돌연변이 스크리닝을 포함하여 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 B. dorsalis 의 돌연변이 유발을 위한 체계적인 방법을 제공합니다. 이 프로토콜은 B. dorsalis의 기능적 유전자 연구에 관심이있는 연구자에게 돌연변이 파리를 생성하는 데 유용한 가이드 역할을합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6x DNA Loading Buffer</td>
			<td>TransGen Biotech</td>
			<td>GH101-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial climate chamber</td>
			<td>ShangHai BluePard</td>
			<td>MGC-350P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxyPrep Genomic DNA Mini-Extraction Kit</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>AP-MN-MS-GDNA-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLAT</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>For searching potential gene loci in the genome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Glass</td>
			<td>WPI&#160;</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>InjectMan 4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A29377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hisat2</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>For aligning the transcriptome to the acquired gene loci</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGV</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>For visualizing the results from Transdecoder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microgrinder</td>
			<td>NARISHIGE</td>
			<td>EG-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>SZ2-ILST</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEASY-Blunt Cloning Kit</td>
			<td>TransGen Biotech</td>
			<td>CB101-02</td>
			<td>https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette cookbook 2018 P-97 &#38; P-1000 Micropipette Pullers</td>
			<td>Instrument Company&#160;</td>
			<td></td>
			<td>https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR HS (Premix)</td>
			<td>Takara Biomedical Technology</td>
			<td>R040A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAMtools</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>For generating the sorted bam files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sgRNAcas9-AI</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>sgRNA design 
			http://123.57.239.141:8080/home</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutter Micropipette Puller Sutter&#160;</td>
			<td>Instrument Company&#160;</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans2K DNA Marker</td>
			<td>TransGen Biotech</td>
			<td>BM101-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transdecoder</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>For combining the results of assemble transcripts and gene loci information 
			https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueCut Cas9 Protein v2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A36498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-trace biological detector</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Nanodrop 2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocols for crispr/cas9 mutagenesis of the oriental fruit fly bactrocera dorsalis

동양 초파리인 박트로세라 등파리 는 감귤류와 전 세계적으로 150종 이상의 다른 과일 작물에 피해를 주는 매우 침습적이고 적응력이 뛰어난 해충 종입니다. 성인 초파리는 비행 능력이 뛰어나고 암컷은 과일 껍질 아래에 알을 낳기 때문에 해충과 직접 접촉해야하는 살충제는 일반적으로 현장에서 제대로 작동하지 않습니다. 분자 생물학적 도구와 고처리량 시퀀싱 기술의 개발로 많은 과학자들이 환경 친화적인 해충 관리 전략을 개발하려고 시도하고 있습니다. 여기에는 다양한 해충에서 검색 행동에 관여하는 후각 유전자와 같은 유전자 (분자 표적)를 하향 조절하거나 침묵시키는 RNAi 또는 유전자 편집 기반 살충제가 포함됩니다. 동양 초파리 방제에 대한 이러한 전략을 적용하려면 기능적 유전자 연구를위한 효과적인 방법이 필요합니다. B. dorsalis의 생존과 번식에 중요한 기능을 가진 유전자는 유전자 녹다운 및/또는 침묵을 위한 좋은 분자 표적 역할을 합니다. CRISPR/Cas9 시스템은 특히 곤충에서 유전자 편집에 사용되는 신뢰할 수 있는 기술입니다. 이 논문은 가이드 RNA의 설계 및 합성, 배아 수집, 배아 주입, 곤충 사육 및 돌연변이 스크리닝을 포함하여 B. dorsalis의 CRISPR / Cas9 돌연변이 유발에 대한 체계적인 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 B. dorsalis의 기능적 유전자 연구에 관심이있는 연구자에게 돌연변이 파리를 생성하는 데 유용한 가이드 역할을합니다.

이 프로토콜은 gDNA 선택, 배아 및 미세 주입 수집, 곤충 유지 관리 및 돌연변이 스크리닝의 대표 결과를 포함하여 CRISPR/Cas9 기술을 사용하여 B. dorsalis 돌연변이를 개발하는 자세한 단계를 제공합니다.
선택된 유전자의 표적 부위의 예는 세 번째 엑손에 위치한다(도 1C). 이 부위는 고도로 보존되어 있고, 단일 밴드는 합성 gRNA (도 1D</st...

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Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

이 논문은 동양 초파리 박트로세라 등쪽의 CRISPR/Cas9 돌연변이 유발에 대한 단계별 프로토콜을 제시합니다. 이 표준화 된 프로토콜에 의해 제공되는 상세한 단계는 B. dorsalis에서 기능적 유전자 연구를위한 돌연변이 파리를 생성하는 데 유용한 가이드 역할을합니다.

동양 초파리 박트로세라 등쪽의 CRISPR/Cas9 돌연변이 유발에 대한 프로토콜

The Oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis, is a highly invasive and adaptive pest species that causes damage to citrus and over 150 other fruit crops ...

동양 초파리는 매우 침습적이고 적응력이 뛰어난 해충 종입니다. 기능적 유전자 연구를위한 효과적인 방법은 환경 친화적 인 해충 관리 전략을 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 고효율 및 저비용입니다.우리의 프로토콜은 동양 초파리 연구자를위한 돌연변이 파리를 생성하는 데 유용한 가이드 역할을 할 것입니다. 시작하려면 관심 대상 유전자의 구조를 예측하고 Bactroceras dorsalis 게놈의 생물 정보학 분석을 통해 엑손과 인트론 사이의 경계를 결정합니다. 시판되는 gRNA 합성 키트를 사용하여 설계된 sgRNA를 생성하십시오.gRNA 생성물을 뉴클레아제가 없는 물에 재현탁시킵니다. UV 가시광선 분광 광도계를 사용하여 농도를 정량화하고 사용하기 전에 섭씨 80도에서 보관하십시오. B.dorsalis 번데기를 55% 상대 습도, 26.5°C, 14:10 빛/일 주기의 사육 조건으로 플라스틱 케이지에 넣습니다.성인이 닫히면 설탕과 효모의 혼합물을 물과 함께 음식으로 제공하십시오. 대부분의 성인은 출현 후 10 일 후에 성적으로 성숙합니다. 암컷의 번식력을 향상시키기 위해 30-50 럭스의 빛을 가진 라이트 스탠드를 사용하여 배아 수집의 효율성을 향상시킵니다.다음으로, 챔버 뚜껑에서 약 200-1mm 떨어진 산란실에 200 메쉬 거즈를 놓습니다. 미세 주입 설정이 준비되면 케이지에 새 산란실을 넣으십시오. 미세한 젖은 솔을 사용하여 10 분마다 배아를 수집하고 자체 제작 한 주사 판에 정렬하십시오.추가 건조를 피하기 위해 주입하는 동안 배아를 할로 카본 오일에 담그십시오. Cas9 단백질과 상응하는 sgRNA를 각각 마이크로리터당 300나노그램의 농도로 혼합하여 작업 용액을 준비합니다. 그런 다음 1 마이크로 리터의 페놀 레드를 혼합물에 첨가하여 주입 된 배아를 표시하는 편리한 방법으로 사용하십시오.sgRNA의 분해를 피하기 위해 준비된 혼합물을 얼음 위에 놓습니다. 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 유리 주입 바늘을 준비하십시오. 기포를 도입하지 않고 3 마이크로 리터의 혼합물을 주사 바늘에 첨가하십시오.그런 다음 마이크로 그라인더를 사용하여 바늘을 열고 사용 설명서에 따라 마이크로 매니퓰레이터에 연결합니다. 인젝터의 매개변수를 Pi로 500헥토파스칼로 설정합니다. Ti는 0.5 초, PC는 200 헥토 파스칼입니다.객관적인 테이블에 정렬 된 배아가있는 판을 놓습니다. 그런 다음 미세 광학 현미경으로 마이크로피펫 위치를 조정하여 마이크로피펫과 배아를 동일한 평면에 설정합니다. 바늘 끝을 배아의 뒤쪽 또는 식물 기둥에 삽입하십시오.그런 다음 인젝터에서 페달을 밟아 혼합물을 배아로 전달합니다. 약간 붉은 색의 출현은 혼합물에 페놀 레드가 첨가 되었기 때문입니다. 주입 된 배아가있는 주입 플레이트를 인공 기후 챔버에 넣습니다.36 시간 후, 부화 한 유충을 미세한 브러시를 사용하여 애벌레 식단으로 옮깁니다. 더 이상 유충이 부화하지 않을 때까지 매일 3-4 번 유충을 수집하십시오. 다음으로, 성숙한 유충을 젖은 모래에 넣어 번데기를하십시오.번식 단계는 10 일이 걸립니다. 번데기 후, eclosion이 시작되기 전에 번데기를 플라스틱 케이지로 옮깁니다. 신선한 번데기 또는 개별 성인의 단일 중간 다리에서 게놈 DNA를 분리하고 표적 영역을 증폭하기 위해 특정 프라이머를 설계한 후 텍스트 원고에 설명된 사이클링 조건에 따라 중합효소 연쇄 반응 또는 PCR을 수행합니다.이어서, 정제된 PCR 산물을 서열분석한다. 표적 부위에 인접한 여러 개의 겹치는 피크를 검출하면 성공적인 돌연변이 유발을 시사합니다. 서브클로닝의 경우, 정제된 PCR 산물을 무딘 말단 벡터와 혼합하고 섭씨 25도에서 15분 동안 결찰합니다.그런 다음 trans-T1 세포를 넣고 30 분 동안 얼음에 놓습니다. 그런 다음 500 마이크로 리터의 LB 배지를 추가하고 흔들면서 섭씨 37도에서 1 시간 동안 배양합니다. 원심분리하여 상청액을 버린다.펠릿을 다시 현탁하고 LB 플레이트에 펼칩니다. 섭씨 37도에서 밤새 배양을 위해 플레이트를 놓습니다. 그런 다음 시퀀싱을 위해 개별 박테리아 콜로니를 선택하여 돌연변이체의 유전자형을 확인합니다.본 연구에서, 선택된 유전자의 표적 부위의 예는 제3 엑손에 위치한다. 표적 부위는 고도로 보존되고, 시험관내 전사에서 수득된 합성 gRNA 및 gRNA를 위한 DNA 주형에 대한 겔 전기영동에 의해 단일 밴드를 검출하였다. B. 미세 주사 후 등쪽 생존 및 돌연변이 유발이 여기에 표시됩니다.PCR 산물을 시퀀싱한 후 G0 개체의 80%가 모자이크 돌연변이입니다. 돌연변이체 스크리닝에서, 8-염기쌍 결실을 갖는 돌연변이체는 아미노산 번역의 조기 종료를 초래하였다. 배아의 뒤쪽 영역이나 식물 극에 바늘을 삽입하는 것은 난자의 생존에 직접적인 영향을 미치기 때문에 중심 단계입니다.이 기술은 B.Dorsalis의 유전자 기능 영역을 연구하기위한 참고 자료를 제공합니다. 그들은이 방법을 통해 원하는 돌연변이를 빠르게 포착 할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

(과일 파리) Drosophila의 침략을 유학

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

연구

생물학

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

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에서 단백질의 감독 진화에 대한 돌연변이 유발 및 기능 선택 프로토콜 E. 대장균</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

분리 및 과일 손톱의 Biophysical 연구

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

CRISPR / Cas9를 통해 포유 동물 세포주의 게놈에 삭제 세대

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

불꽃을 침묵 : 약한 전기 물고기에서 CRISPR / Cas9 게놈 편집

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9를 사용하여 Null 돌연변이를 생성하기 위해 컬렉스 모기의 배아를 준비하고 주입합니다.

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9를 사용하여 1차 인간 B 세포의 게놈 공학

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells for Gene Therapy Applications

유전자 치료 애플리케이션을 위한 조혈 줄기 및 전구 세포의 CRISPR/Cas9 유전자 편집

CRISPR/Cas9 is a highly versatile and efficient gene-editing tool adopted widely to correct various genetic mutations. The feasibility of gene ...

CRISPR-Cas9-Mediated Precise Knock-In Edits in Zebrafish Hearts

CRISPR-Cas9 매개 제브라피쉬 하트의 정확한 녹인 편집

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) in animal models enable precise genetic manipulation for the study of physiological ...