Name: microfluidics-assisted selective depolarization of axonal mitochondria
Uploaded: 2022-08-04T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidics-Assisted Selective Depolarization of Axonal Mitochondria at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet af den tyske forskningsfond (HA 7728/2-1 og EXC2145 Project ID 390857198) og Max Planck Society.

Alle dyreforsøg blev udført efter de relevante retningslinjer og regler fra regeringen i Oberbayern. De primære neuroner blev fremstillet ud fra E16.5 C57BL/6 vildtype museembryoner af begge køn efter standardmetoder som tidligere beskrevet6.
1. Samling af den mikrofluidiske enhed
<ol><li>Belæg en seks-brønds glasbundet vævskulturplade med en endelig koncentration på 20 μg/ml Poly-D-lysin og 3,4 μg/ml Laminin i PBS (fosfatbufferet saltvand) ...

<ol>
	<li>Murali Mahadevan, H., Hashemiaghdam, A., Ashrafi, G., Harbauer, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+neuronal+health:+from+energy+metabolism+to+Parkinson's+disease.">Mitochondria in neuronal health: from energy metabolism to Parkinson's disease.</a> Advanced Biology. 5 (9), 2100663 (2021).</li><li>Dauer, W., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease:+mechanisms+and+models.">Parkinson's disease: mechanisms and models.</a> Neuron. 39 (6), 889-909 (2003).</li><li>Moratalla, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+vulnerability+of+primate+caudate-putamen+and+striosome-matrix+dopamine+systems+to+the+neurotoxic+effects+of+1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-+tetrahydropyridine.">Differential vulnerability of primate caudate-putamen and striosome-matrix dopamine systems to the neurotoxic effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- tetrahydropyridine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (9), 3859-3863 (1992).</li><li>Cheng, H. -. C., Ulane, C. M., Burke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+progression+in+Parkinson+disease+and+the+neurobiology+of+axons.">Clinical progression in Parkinson disease and the neurobiology of axons.</a> Annals of Neurology. 67 (6), 715-725 (2010).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury,+regeneration+and+transport.">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).</li><li>Harbauer, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+mitochondria+transport+Pink1+mRNA+via+synaptojanin+2+to+support+local+mitophagy.">Neuronal mitochondria transport Pink1 mRNA via synaptojanin 2 to support local mitophagy.</a> Neuron. 110 (9), 1516-1531 (2022).</li><li>Ashrafi, G., Schlehe, J. S., LaVoie, M. J., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+of+damaged+mitochondria+occurs+locally+in+distal+neuronal+axons+and+requires+PINK1+and+Parkin.">Mitophagy of damaged mitochondria occurs locally in distal neuronal axons and requires PINK1 and Parkin.</a> Journal of Cell Biology. 206 (5), 655-670 (2014).</li><li>Shipman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine&#235;thanesulfonic+acid+(HEPES)+as+a+tissue+culture+buffer.">Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine&#235;thanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 130 (1), 305-310 (1969).</li><li>Harbauer, A. B., Schneider, A., Wohlleber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondria+by+single-organelle+resolution.">Analysis of mitochondria by single-organelle resolution.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 15, 1-16 (2022).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+mRNA+in+uninjured+and+regenerating+cortical+mammalian+axons.">Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (15), 4697-4707 (2009).</li><li>Altman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+TDP-43+condensates+drive+neuromuscular+junction+disruption+through+inhibition+of+local+synthesis+of+nuclear+encoded+mitochondrial+proteins.">Axonal TDP-43 condensates drive neuromuscular junction disruption through inhibition of local synthesis of nuclear encoded mitochondrial proteins.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).</li></ol>

Den nuværende protokol beskriver en metode til frø og kultur dissocierede hippocampus neuroner i en mikrofluidisk enhed til behandling af aksonale mitokondrier separat. Nytten af denne tilgang med det membranfølsomme farvestof TMRE og den komplekse III-hæmmer Antimycin A (som tidligere demonstreret7) demonstreres her, men denne metode kan let tilpasses andre mitokondriefarvestoffer eller genetisk kodede sensorer af mitokondriefunktioner, der tillader lokale, mikroskopibaserede udlæsninger<sup...

Mitokondrier er de vigtigste leverandører af ATP (adenosintrifosfat) i neuroner. Da neuronal sundhed er tæt forbundet med mitokondriefunktion, er det ikke overraskende, at dysfunktionel regulering af disse organeller har været forbundet med begyndelsen af forskellige neurodegenerative sygdomme, herunder Parkinsons sygdom1. Desuden er mitokondriel forgiftning med succes blevet brugt til at modellere Parkinsons symptomer hos dyr2. I både dyremodeller og menneskelig sygdom starter neuronernes død ved de distale dele3,4, hvilket antyder, at aksonale mitokondrier kan være mere modtagelige for fornærmelser. Imidlertid er mitokondriernes biologi i axoner ikke godt forstået på grund af de vanskeligheder, der er forbundet med målrettet behandling og analyse af aksonale mitokondrier uden samtidig forstyrrelse af cellekropsprocesser.
Nylige fremskridt inden for dyrkningsteknikker af dissocierede neuroner in vitro tillader nu fluidisk adskillelse af axoner og cellelegemer gennem mikrofluidiske enheder5. Som vist i figur 1A har disse enheder fire adgangsbrønde (a/h og c/i), med to kanaler, der forbinder hvert par (d og f). De store kanaler er forbundet med hinanden med en serie på 450 μm lange mikrokanaler (e). Forsætlige forskelle i påfyldningsniveauerne mellem de to kamre skaber en væsketrykgradient (figur 1B), der forhindrer diffusion af små molekyler fra kanalen med et lavere væskeniveau til den anden side (figur 1C, illustreret med Trypan blåt farvestof).
Vi brugte for nylig mikrofluidiske enheder til at studere lokale oversættelseskrav i aksonal mitofagi, selektiv fjernelse af beskadigede mitokondrier6. I den nuværende protokol præsenteres forskellige trin for at inducere lokal mitokondrieskade gennem selektiv behandling af axoner ved anvendelse af mitokondriekomplekset III-hæmmeren Antimycin A 6,7.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well Glass bottom plate</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06.1.5H-N</td>
			<td>Silicone device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS M5000 widefield microscope</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td>EVOS M5000</td>
			<td>fully integrated digital widefield microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibernate E</td>
			<td>BrainBits</td>
			<td>HE500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted spinning disk confocal</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TI2-E + CSU-W1</td>
			<td>With incubator chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic devices</td>
			<td>XONA microfluidics</td>
			<td>RD450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRE</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>87917</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidics-assisted selective depolarization of axonal mitochondria

Mitokondrier er de primære leverandører af ATP (adenosintrifosfat) i neuroner. Mitokondrie dysfunktion er en almindelig fænotype i mange neurodegenerative sygdomme. I betragtning af nogle axoners udførlige arkitektur og ekstreme længde er det ikke overraskende, at mitokondrier i axoner kan opleve forskellige miljøer sammenlignet med deres cellekropsmodstykker. Interessant nok går dysfunktion af aksonale mitokondrier ofte forud for virkninger på cellekroppen. For at modellere aksonal mitokondriel dysfunktion in vitro tillader mikrofluidiske enheder behandling af aksonale mitokondrier uden at påvirke de somale mitokondrier. Den flydende trykgradient i disse kamre forhindrer diffusion af molekyler mod gradienten, hvilket muliggør analyse af mitokondrieegenskaber som reaktion på lokale farmakologiske udfordringer inden for axoner. Den nuværende protokol beskriver såning af dissocierede hippocampale neuroner i mikrofluidiske enheder, farvning med et membranpotentielt følsomt farvestof, behandling med et mitokondrietoksin og den efterfølgende mikroskopiske analyse. Denne alsidige metode til at studere aksonal biologi kan anvendes på mange farmakologiske forstyrrelser og billeddannelsesaflæsninger og er velegnet til flere neuronale undertyper.

Primære hippocampale neuroner blev dyrket i mikrofluidiske enheder i 7-8 dage, før mitokondrier blev farvet med det membranfølsomme farvestof (TMRE) i 25 minutter i begge kanaler. Som vist i figur 2A gav dette homogen farvning af mitokondrier på begge sider af mikrorillerne, men det var utilstrækkeligt til at ligevægte farvningen i midten af mikrorillerne. Ved tilsætning af Antimycin A til den aksonale side bevarede somale mitokondrier TMRE-signalet (figur 2B</str...

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidics-Assisted Selective Depolarization of Axonal Mitochondria at JoVE.com

Microfluidics-Assisted Selective Depolarization of Axonal Mitochondria

Den nuværende protokol beskriver såning og farvning af neuronale mitokondrier i mikrofluidiske kamre. Den flydende trykgradient i disse kamre muliggør selektiv behandling af mitokondrier i axoner for at analysere deres egenskaber som reaktion på farmakologiske udfordringer uden at påvirke cellelegemets rum.

Mikrofluidik-assisteret selektiv depolarisering af aksonale mitokondrier

Mitochondria are the primary suppliers of ATP (adenosine triphosphate) in neurons. Mitochondrial dysfunction is a common phenotype in many ...

Mitokondrier er afgørende for neuronal sundhed. I mange neurodegenerative sygdomme er axonale mitokondrier de første, der lider, men det er ikke klart, hvad der gør aksonale mitokondrier så specielle. Den flydende trykgradient i kamrene, der anvendes i denne protokol, muliggør selektiv behandling af mitokondrion axoner.Dette efterlader cellekropsprocesser uforstyrret og giver os mulighed for at fokusere på aksonal biologi. Vi viser her depolariseringen af mitokondrier med et membranpotentielt følsomt farvestof, men denne metode kan anvendes på mange forskellige neuronale celletyper og fluorescerende aflæsninger. Til at begynde med skal du placere de kodede seks brøndplader i en steril hætte og vaske dem to gange med sterilt dobbeltdestilleret vand.Lad pladerne tørre i en vippet position i tre til fem minutter. Fjern overskydende vand ved vakuumsugning eller pipettering. Derefter blødlægges mikrofluidkammeret i 80% ethanol.Tør igen det mikrofluidiske kammer i tre til fem minutter i en vippet position, og fjern overskydende ethanol med en pipettespids. Når det er helt tørt, skal du placere det mikrofluidiske kammer i midten af brønden og pladen. Bank forsigtigt på mikrofluidkammeret ved dets grænser og mikrorillesektionen i midten for korrekt fastgørelse til glaspladen.Først indsamles det ønskede antal dissocierede hippocampale neuroner i et 1, 5 ml reaktionsrør. Centrifuge røret ved 1000 gange G i fire minutter ved stuetemperatur. Kassér supernatanten, og suspender pelleten i otte mikroliter B-27 neuro basalmedier.Dispenser derefter celleopløsningen i kanalindgangen til det mikrofluidiske kammer. Tryk på bagsiden af pladen for at hjælpe strømmen gennem kanalen. Brug en pipette til at aspirere enhver resterende cellesuspension ved udgangen af kanalen.Inkuber det mikrofluidiske kammer med celler i 15 til 20 minutter ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. Fyld derefter den øverste axonale brønd med 50 mikroliter B-27 neurobasale medier, og tryk på bagsiden af pladen for at hjælpe strømmen. Fyld hver brønd på soma-siden med 150 mikroliter B-27 neurobasale medier, hvilket skaber en spændingsboble ovenpå.Fyld også begge brønde på den aksonale side med 100 mikroliter B-27 neurobasale medier hver. Efter syv til otte dages in vitro-kultur skal du sikre dig, at axonerne er vokset gennem mikrorillerne og forlænget ind i det aksonale rum. Vask enheden ved at fjerne B-27 neurobasalmediet og tilsæt 100 mikroliter forvarmet billeddannelsesmedium til de øverste brønde i både axonal- og somakanalerne.Lad mediet strømme igennem til de nederste brønde. Fjern mediet fra de nederste brønde og eventuelle rester fra de øverste brønde, og gentag med frisk medium, så brøndene er tomme i slutningen af vasken. Derefter tilsættes 100 mikroliter fem nanomolære TMRE-fortyndinger til både de somatiske og de aksonale topbrønde.Lad mediet strømme gennem begge rum, indtil der er et lige stort volumen i alle brønde. Fyld op med TMRE-indeholdende medium. Vælg et område af interesse i det somatiske rum, og følg det gennem mikrorillerne ind i det aksonale rum.Sørg for, at mikrorillerne afbildet i de somatiske og aksonale rum matches med hinanden. Når du har ændret filnavnet, skal du erhverve røde fluorescensbilleder ved hjælp af 561 nanometer excitation og 625 nanometer emissionsbølgelængder. Sørg for en volumenforskel mellem soma og axonale kamre ved at kontrollere tilstedeværelsen af en spændingsboble på den somatiske side.Fjern derefter billedmediet fra begge brønde på den aksonale side, bortset fra mediet inde i kanalen. For at inducere mitokondriel depolarisering tilsættes 160 mikroliter 20 mikromolær antimycin A fortyndet i billeddannelsesmediet til den øverste axonale brønd. Lad det strømme gennem kanalen, indtil der er et lige stort volumen i begge aksonale brønde.Gentag billeddannelsen, og sørg for, at de samme positioner afbildes som under baseline-anskaffelsen ved at identificere mikrorillerne. Ved hjælp af denne protokol blev primære hippocampale neuroner dyrket i mikrofluidiske enheder efterfulgt af mitokondriefarvning med et membranfølsomt farvestof, TMRE. Homogen farvning af mitokondrier blev observeret på begge sider af mikrorillerne, men ikke i midten.Ved tilsætning af antimycin A til den aksonale side bevarede somale mitokondrier TMRE-signalet, mens fluorescensen gik tabt fra de aksonale mitokondrier Sørg for, at der ikke efterlades fugt i brønden eller på enheden, før du samler enheden. Ellers vil kamrene ikke blive forseglet. Ved hjælp af denne metode kan vi studere virkningerne af tab af mitokondriefunktion i axon- og lokale funktioner samt dens indflydelse på retrograd signalering og global celleoverlevelse.Mitokondriel biogenese var længe blevet antaget at ske udelukkende i cellekroppen. Denne metode gjorde det muligt for os at afsløre, at aksonale mitokondrier skader krævede lokal oversættelse af manglen på protein PINK1.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mechanical Manipulation of Neurons to Control Axonal Development

Cell manipulations and extension of neuronal axons can be accomplished with calibrated glass micro-fibers capable of measuring and applying forces in the ...

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Elektroporation af baghjerne at spore axonale baner og Synaptic Mål i Chick Embryo

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

Selektiv Tracing af Auditive fibre i de Avian embryoer Vestibulocochlear Nerve

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

Subtype-selektive Elektroporation af Kortikal interneuroner

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

Real-time Imaging af axonal Transport af Quantum Dot-mærket BDNF i Primary neuroner

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

Characterizing the Composition of Molecular Motors on Moving Axonal Cargo Using "Cargo Mapping" Analysis

Karakterisere sammensætningen af ​​Molecular Motors på Moving axonal Cargo Brug af &quot;Cargo Mapping&quot; Analyse

Understanding the mechanisms by which molecular motors coordinate their activities to transport vesicular cargoes within neurons requires the quantitative ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

Tre-dimensionelle billedbehandling og analyse af mitochondrier i menneskelige Intraepidermal nervefibre

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Analyse af Brain mitokondrier Brug Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualisering af Axonal Projeksionsmønsteret af Embryoniske Motor Neuroner i<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...