Name: microfluidics-assisted selective depolarization of axonal mitochondria
Uploaded: 2022-08-04T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidics-Assisted Selective Depolarization of Axonal Mitochondria at JoVE.com

Deze studie werd ondersteund door de Duitse Onderzoeksstichting (HA 7728/2-1 en EXC2145 Project ID 390857198) en de Max Planck Society.

Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de relevante richtlijnen en voorschriften van de regering van Opper-Beieren. De primaire neuronen werden bereid uit E16.5 C57BL/6 wild-type muisembryo's van beide geslachten volgens standaardmethoden zoals eerder beschreven6.
1. Montage van het microfluïdische apparaat
<ol><li>Bekleed een weefselkweekplaat met zes putten met glazen bodem met een eindconcentratie van 20 μg/ml poly-D-lysine en 3,4 μg/ml lami...

<ol>
	<li>Murali Mahadevan, H., Hashemiaghdam, A., Ashrafi, G., Harbauer, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+neuronal+health:+from+energy+metabolism+to+Parkinson's+disease.">Mitochondria in neuronal health: from energy metabolism to Parkinson's disease.</a> Advanced Biology. 5 (9), 2100663 (2021).</li><li>Dauer, W., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease:+mechanisms+and+models.">Parkinson's disease: mechanisms and models.</a> Neuron. 39 (6), 889-909 (2003).</li><li>Moratalla, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+vulnerability+of+primate+caudate-putamen+and+striosome-matrix+dopamine+systems+to+the+neurotoxic+effects+of+1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-+tetrahydropyridine.">Differential vulnerability of primate caudate-putamen and striosome-matrix dopamine systems to the neurotoxic effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- tetrahydropyridine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (9), 3859-3863 (1992).</li><li>Cheng, H. -. C., Ulane, C. M., Burke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+progression+in+Parkinson+disease+and+the+neurobiology+of+axons.">Clinical progression in Parkinson disease and the neurobiology of axons.</a> Annals of Neurology. 67 (6), 715-725 (2010).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury,+regeneration+and+transport.">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).</li><li>Harbauer, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+mitochondria+transport+Pink1+mRNA+via+synaptojanin+2+to+support+local+mitophagy.">Neuronal mitochondria transport Pink1 mRNA via synaptojanin 2 to support local mitophagy.</a> Neuron. 110 (9), 1516-1531 (2022).</li><li>Ashrafi, G., Schlehe, J. S., LaVoie, M. J., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+of+damaged+mitochondria+occurs+locally+in+distal+neuronal+axons+and+requires+PINK1+and+Parkin.">Mitophagy of damaged mitochondria occurs locally in distal neuronal axons and requires PINK1 and Parkin.</a> Journal of Cell Biology. 206 (5), 655-670 (2014).</li><li>Shipman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine&#235;thanesulfonic+acid+(HEPES)+as+a+tissue+culture+buffer.">Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine&#235;thanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 130 (1), 305-310 (1969).</li><li>Harbauer, A. B., Schneider, A., Wohlleber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondria+by+single-organelle+resolution.">Analysis of mitochondria by single-organelle resolution.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 15, 1-16 (2022).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+mRNA+in+uninjured+and+regenerating+cortical+mammalian+axons.">Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (15), 4697-4707 (2009).</li><li>Altman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+TDP-43+condensates+drive+neuromuscular+junction+disruption+through+inhibition+of+local+synthesis+of+nuclear+encoded+mitochondrial+proteins.">Axonal TDP-43 condensates drive neuromuscular junction disruption through inhibition of local synthesis of nuclear encoded mitochondrial proteins.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).</li></ol>

Het huidige protocol beschrijft een methode om gedissocieerde hippocampale neuronen te zaaien en te kweken in een microfluïdisch apparaat om axonale mitochondriën afzonderlijk te behandelen. Het nut van deze aanpak met de membraangevoelige kleurstof TMRE en de complexe III-remmer Antimycine A (zoals eerder aangetoond7) wordt hier gedemonstreerd, maar deze methode kan gemakkelijk worden aangepast aan andere mitochondriale kleurstoffen of genetisch gecodeerde sensoren van mitochondriale functies d...

Mitochondriën zijn de belangrijkste leveranciers van ATP (adenosinetrifosfaat) in neuronen. Aangezien neuronale gezondheid nauw verbonden is met mitochondriale functie, is het niet verrassend dat disfunctionele regulatie van deze organellen in verband is gebracht met het ontstaan van verschillende neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Parkinson1. Bovendien is mitochondriale intoxicatie met succes gebruikt om parkinsonsymptomen bij dieren 2 temodelleren. In zowel diermodellen als menselijke ziekten begint de ondergang van neuronen bij de distale delen 3,4, wat erop wijst dat axonale mitochondriën mogelijk vatbaarder zijn voor beledigingen. De biologie van mitochondriën in axonen is echter niet goed begrepen vanwege de moeilijkheden die gepaard gaan met gerichte behandeling en analyse van axonale mitochondriën zonder gelijktijdige verstoring van cellichaamsprocessen.
Recente ontwikkelingen in kweektechnieken van gedissocieerde neuronen in vitro maken nu de vloeiende scheiding van axonen en cellichamen mogelijk via microfluïdische apparaten5. Zoals afgebeeld in figuur 1A, hebben deze apparaten vier toegangsputten (a / h en c / i), met twee kanalen die elk paar verbinden (d en f). De grote kanalen zijn met elkaar verbonden door een reeks van 450 μm lange microkanalen (e). Opzettelijke verschillen in de vulniveaus tussen de twee kamers creëren een vloeistofdrukgradiënt (figuur 1B) die de diffusie van kleine moleculen van het kanaal met een lager vloeistofniveau naar de andere kant voorkomt (figuur 1C, geïllustreerd met Trypan blauwe kleurstof).
We hebben onlangs microfluïdische apparaten gebruikt om lokale vertaalvereisten in axonale mitofagie te bestuderen, de selectieve verwijdering van beschadigde mitochondriën6. In dit protocol worden verschillende stappen gepresenteerd om lokale mitochondriale schade te induceren door selectieve behandeling van axonen met behulp van de mitochondriale complex III-remmer Antimycine A 6,7.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well Glass bottom plate</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06.1.5H-N</td>
			<td>Silicone device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS M5000 widefield microscope</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td>EVOS M5000</td>
			<td>fully integrated digital widefield microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibernate E</td>
			<td>BrainBits</td>
			<td>HE500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted spinning disk confocal</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TI2-E + CSU-W1</td>
			<td>With incubator chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic devices</td>
			<td>XONA microfluidics</td>
			<td>RD450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRE</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>87917</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidics-assisted selective depolarization of axonal mitochondria

Mitochondriën zijn de primaire leveranciers van ATP (adenosinetrifosfaat) in neuronen. Mitochondriale disfunctie is een veel voorkomend fenotype bij veel neurodegeneratieve ziekten. Gezien de uitgebreide architectuur en extreme lengte van sommige axonen, is het niet verrassend dat mitochondriën in axonen verschillende omgevingen kunnen ervaren in vergelijking met hun tegenhangers van het cellichaam. Interessant is dat disfunctie van axonale mitochondriën vaak voorafgaat aan effecten op het cellichaam. Om axonale mitochondriale disfunctie in vitro te modelleren, maken microfluïdische apparaten behandeling van axonale mitochondriën mogelijk zonder de somale mitochondriën te beïnvloeden. De fluïde drukgradiënt in deze kamers voorkomt diffusie van moleculen tegen de gradiënt, waardoor analyse van mitochondriale eigenschappen mogelijk is als reactie op lokale farmacologische uitdagingen binnen axonen. Het huidige protocol beschrijft het zaaien van gedissocieerde hippocampusneuronen in microfluïdische apparaten, kleuring met een membraanpotentiaal gevoelige kleurstof, behandeling met een mitochondriaal toxine en de daaropvolgende microscopische analyse. Deze veelzijdige methode om axonale biologie te bestuderen kan worden toegepast op veel farmacologische verstoringen en beeldvormingsuitlezingen en is geschikt voor verschillende neuronale subtypen.

Primaire hippocampusneuronen werden gekweekt in microfluïdische apparaten gedurende 7-8 dagen voordat mitochondriën gedurende 25 minuten in beide kanalen werden gekleurd met de membraangevoelige kleurstof (TMRE). Zoals te zien is in figuur 2A, leverde dit homogene kleuring van mitochondriën aan beide zijden van de microgrooves op, maar het was onvoldoende om de kleuring in het midden van de microgrooves in evenwicht te brengen. Na toevoeging van Antimycine A aan de axonale zijde behielden...

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidics-Assisted Selective Depolarization of Axonal Mitochondria at JoVE.com

Microfluidics-Assisted Selective Depolarization of Axonal Mitochondria

Het huidige protocol beschrijft het zaaien en kleuren van neuronale mitochondriën in microfluïdische kamers. De vloeiende drukgradiënt in deze kamers maakt de selectieve behandeling van mitochondriën in axonen mogelijk om hun eigenschappen te analyseren als reactie op farmacologische uitdagingen zonder het cellichaamcompartiment te beïnvloeden.

Microfluïdica-geassisteerde selectieve depolarisatie van axonale mitochondriën

Mitochondria are the primary suppliers of ATP (adenosine triphosphate) in neurons. Mitochondrial dysfunction is a common phenotype in many ...

Mitochondriën zijn essentieel voor de neuronale gezondheid. Bij veel neurodegeneratieve ziekten zijn axonale mitochondriën de eerste die lijden, maar het is niet duidelijk wat axonale mitochondriën zo speciaal maakt. De vloeistofdrukgradiënt in de kamers die in dit protocol worden gebruikt, maakt de selectieve behandeling van mitochondrion-axonen mogelijk.Dit laat cellichaamprocessen ongestoord en stelt ons in staat om ons te concentreren op axonale biologie. We tonen hier de depolarisatie van mitochondriën met een membraanpotentiaalgevoelige kleurstof, maar deze methode kan worden toegepast op veel verschillende neuronale celtypen en fluorescerende uitlezingen. Plaats om te beginnen de gecodeerde zes putplaten in een steriele kap en was ze twee keer met steriel dubbel gedestilleerd water.Laat de platen drie tot vijf minuten in een gekantelde positie drogen. Verwijder overtollig water door vacuüm zuigen of pipetteren. Week vervolgens de microfluïdische kamer in 80% ethanol.Nogmaals, droog de microfluïdische kamer gedurende drie tot vijf minuten in een gekantelde positie en verwijder overtollige ethanol met een pipetpunt. Wanneer het volledig droog is, plaatst u de microfluïdische kamer in het midden van de put en de plaat. Tik voorzichtig op de microfluïdische kamer aan de randen en het microgroove-gedeelte in het midden voor een goede bevestiging aan de glasplaat.Verzamel eerst het gewenste aantal gedissocieerde hippocampusneuronen in een reactiebuis van 1,5 milliliter. Centrifugeer de buis op 1000 maal G gedurende vier minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg en resuspenseer de pellet in acht microliter B-27 neuro basale media.Doseer vervolgens de celoplossing in de kanaalingang van de microfluïdische kamer. Tik op de achterkant van de plaat om de stroom door het kanaal te ondersteunen. Gebruik een pipet om de resterende celsuspensie aan de uitgang van het kanaal aan te zuigen.Incubeer de microfluïdische kamer met cellen gedurende 15 tot 20 minuten bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Vul vervolgens de bovenste axonale put met 50 microliter B-27 neurobasale media en tik op de achterkant van de plaat om de stroom te ondersteunen. Vul elke put aan de somazijde met 150 microliter B-27 neurobasale media, waardoor er een spanningsbel bovenop ontstaat.Vul ook beide putten van de axonale kant met elk 100 microliter B-27 neurobasale media. Zorg er na zeven tot acht dagen in-vitrokweek voor dat de axonen door de microgrooves zijn gegroeid en zich hebben uitgebreid naar het axonale compartiment. Was het apparaat door het B-27 neurobasale medium te verwijderen en 100 microliter voorverwarmd beeldvormingsmedium toe te voegen aan de bovenste putjes van zowel de axonale als de somakanalen.Laat het medium doorstromen naar de onderste putten. Verwijder het medium uit de onderste putjes en het overgebleven medium uit de bovenste putjes en herhaal dit met vers medium, waarbij de putjes aan het einde van de was leeg blijven. Voeg vervolgens 100 microliter van vijf nanomolaire TMRE-verdunning toe aan zowel de somatische als de axonale bovenste putten.Laat het medium door beide compartimenten stromen, totdat er in alle putten een gelijk volume is. Vul met het TMRE-bevattende medium. Selecteer een interessegebied in het somatische compartiment en volg het door de microgrooves naar het axonale compartiment.Zorg ervoor dat de microgroeven in de somatische en axonale compartimenten op elkaar zijn afgestemd. Nadat u de bestandsnaam hebt gewijzigd, verkrijgt u rode fluorescentiebeelden met behulp van 561 nanometer excitatie en 625 nanometer emissiegolflengten. Zorg voor een volumeverschil tussen de soma- en axonale kamers door de aanwezigheid van een spanningsbel aan de somatische kant te controleren.Verwijder vervolgens het beeldvormende medium uit beide putjes van de axonale zijde, behalve het medium in het kanaal. Om mitochondriale depolarisatie te induceren, voegt u 160 microliter 20 micromolair antimycine A verdund in het beeldvormingsmedium toe aan de bovenste axonale put. Laat het door het kanaal stromen totdat er een gelijk volume is in beide axonale putten.Herhaal de beeldvorming en zorg ervoor dat dezelfde posities worden weergegeven als tijdens de basislijnacquisitie, door de microgrooves te identificeren. Met behulp van dit protocol werden primaire hippocampale neuronen gekweekt in microfluïdische apparaten, gevolgd door mitochondriale kleuring met een membraangevoelige kleurstof, TMRE. Homogene kleuring van mitochondriën werd waargenomen aan beide zijden van de microgrooves, maar niet in het midden.Bij toevoeging van antimycine A aan de axonale kant behielden somale mitochondriën het TMRE-signaal, terwijl de fluorescentie verloren ging uit de axonale mitochondriën Zorg ervoor dat er geen vocht achterblijft in de put of op het apparaat voordat u het apparaat assembleert. Anders worden de kamers niet verzegeld. Met behulp van deze methode kunnen we de effecten van verlies van mitochondriale functie in het axon en lokale functies bestuderen, evenals de invloed ervan op retrograde signalering en wereldwijde celoverleving.Van mitochondriale biogenese werd lang gedacht dat het uitsluitend in het cellichaam voorkwam. Deze methode stelde ons in staat om te onthullen dat axonale mitochondriale schade lokale vertaling van het korte eiwit PINK1 vereiste.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mechanical Manipulation of Neurons to Control Axonal Development

Mechanische Manipulatie van Neuronen om axonale Development Controle

Cell manipulations and extension of neuronal axons can be accomplished with calibrated glass micro-fibers capable of measuring and applying forces in the ...

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Chromatine immunoprecipitatie van achterwortelganglia Tissue volgende axonale schade

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Elektroporatie van de hindbrain om Axonale Trajectories en Synaptic Doelen Trace in de Chick Embryo

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

Selectieve Tracing van auditieve vezels in de Avian Embryonale evenwichtszenuw Nerve

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

Subtype-selectieve Electroporatie van corticale Interneurons

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

Real-time beeldvorming van Axonale Vervoer van Quantum Dot-label BDNF in primaire neuronen

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

Characterizing the Composition of Molecular Motors on Moving Axonal Cargo Using "Cargo Mapping" Analysis

Karakteriseren van de Samenstelling van moleculaire motoren op Moving Axonale Cargo Met behulp van &quot;Cargo Mapping&quot; Analyse

Understanding the mechanisms by which molecular motors coordinate their activities to transport vesicular cargoes within neurons requires the quantitative ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

Driedimensionale beeldvorming en analyse van Mitochondria binnen menselijke Intraepidermal zenuwvezels

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Analyse van de Brain Mitochondriën gebruik van Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualisatie van het Axonal Projectiepatroon van Embryonische Motor Neuronen in<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...