Name: microfluidics-assisted selective depolarization of axonal mitochondria
Uploaded: 2022-08-04T14:15:00
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Cette étude a été soutenue par la Fondation allemande pour la recherche (HA 7728/2-1 et EXC2145 Project ID 390857198) et la Société Max Planck.

Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément aux directives et réglementations pertinentes du gouvernement de Haute-Bavière. Les neurones primaires ont été préparés à partir d’embryons de souris sauvages E16.5 C57BL/6 des deux sexes selon les méthodes standard décrites précédemment6.
1. Assemblage du dispositif microfluidique
<ol><li>Enduire une plaque de culture tissulaire à fond de verre à six puits avec...

<ol>
	<li>Murali Mahadevan, H., Hashemiaghdam, A., Ashrafi, G., Harbauer, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+neuronal+health:+from+energy+metabolism+to+Parkinson's+disease.">Mitochondria in neuronal health: from energy metabolism to Parkinson's disease.</a> Advanced Biology. 5 (9), 2100663 (2021).</li><li>Dauer, W., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease:+mechanisms+and+models.">Parkinson's disease: mechanisms and models.</a> Neuron. 39 (6), 889-909 (2003).</li><li>Moratalla, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+vulnerability+of+primate+caudate-putamen+and+striosome-matrix+dopamine+systems+to+the+neurotoxic+effects+of+1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-+tetrahydropyridine.">Differential vulnerability of primate caudate-putamen and striosome-matrix dopamine systems to the neurotoxic effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- tetrahydropyridine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (9), 3859-3863 (1992).</li><li>Cheng, H. -. C., Ulane, C. M., Burke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+progression+in+Parkinson+disease+and+the+neurobiology+of+axons.">Clinical progression in Parkinson disease and the neurobiology of axons.</a> Annals of Neurology. 67 (6), 715-725 (2010).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury,+regeneration+and+transport.">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).</li><li>Harbauer, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+mitochondria+transport+Pink1+mRNA+via+synaptojanin+2+to+support+local+mitophagy.">Neuronal mitochondria transport Pink1 mRNA via synaptojanin 2 to support local mitophagy.</a> Neuron. 110 (9), 1516-1531 (2022).</li><li>Ashrafi, G., Schlehe, J. S., LaVoie, M. J., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+of+damaged+mitochondria+occurs+locally+in+distal+neuronal+axons+and+requires+PINK1+and+Parkin.">Mitophagy of damaged mitochondria occurs locally in distal neuronal axons and requires PINK1 and Parkin.</a> Journal of Cell Biology. 206 (5), 655-670 (2014).</li><li>Shipman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine&#235;thanesulfonic+acid+(HEPES)+as+a+tissue+culture+buffer.">Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine&#235;thanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 130 (1), 305-310 (1969).</li><li>Harbauer, A. B., Schneider, A., Wohlleber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondria+by+single-organelle+resolution.">Analysis of mitochondria by single-organelle resolution.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 15, 1-16 (2022).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+mRNA+in+uninjured+and+regenerating+cortical+mammalian+axons.">Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (15), 4697-4707 (2009).</li><li>Altman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+TDP-43+condensates+drive+neuromuscular+junction+disruption+through+inhibition+of+local+synthesis+of+nuclear+encoded+mitochondrial+proteins.">Axonal TDP-43 condensates drive neuromuscular junction disruption through inhibition of local synthesis of nuclear encoded mitochondrial proteins.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).</li></ol>

Le présent protocole décrit une méthode pour ensemencer et cultiver des neurones hippocampiques dissociés dans un dispositif microfluidique pour traiter séparément les mitochondries axonales. L’utilité de cette approche avec le colorant TMRE sensible à la membrane et l’inhibiteur complexe III Antimycin A (comme démontré précédemment7) est démontrée ici, mais cette méthode peut être facilement adaptée à d’autres colorants mitochondriaux ou capteurs génétiquement codés des...

Les mitochondries sont les principaux fournisseurs d’ATP (adénosine triphosphate) dans les neurones. Comme la santé neuronale est intimement liée à la fonction mitochondriale, il n’est pas surprenant que la régulation dysfonctionnelle de ces organites ait été associée à l’apparition de diverses maladies neurodégénératives, dont la maladie de Parkinson1. De plus, l’intoxication mitochondriale a été utilisée avec succès pour modéliser les symptômes parkinsoniens chez les animaux2. Dans les modèles animaux et les maladies humaines, la disparition des neurones commence aux parties distales3,4, ce qui suggère que les mitochondries axonales pourraient être plus sensibles aux insultes. Cependant, la biologie des mitochondries dans les axones n’est pas bien comprise en raison des difficultés associées au traitement ciblé et à l’analyse des mitochondries axonales sans perturbation simultanée des processus du corps cellulaire.
Les progrès récents dans les techniques de culture de neurones dissociés in vitro permettent maintenant la séparation fluidique des axones et des corps cellulaires grâce à des dispositifs microfluidiques5. Comme le montre la figure 1A, ces dispositifs comportent quatre puits d’accès (a/h et c/i), avec deux canaux reliant chaque paire (d et f). Les grands canaux sont reliés entre eux par une série de microcanaux de 450 μm de long (e). Les différences intentionnelles dans les niveaux de remplissage entre les deux chambres créent un gradient de pression du fluide (Figure 1B) qui empêche la diffusion de petites molécules du canal avec un niveau de fluide inférieur de l’autre côté (Figure 1C, illustrée avec un colorant bleu trypan).
Nous avons récemment utilisé des dispositifs microfluidiques pour étudier les besoins de traduction locale en mitophagie axonale, l’élimination sélective des mitochondries endommagées6. Dans le présent protocole, différentes étapes sont présentées pour induire des lésions mitochondriales locales par traitement sélectif des axones à l’aide de l’inhibiteur du complexe mitochondrial III Antimycine A 6,7.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well Glass bottom plate</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06.1.5H-N</td>
			<td>Silicone device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS M5000 widefield microscope</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td>EVOS M5000</td>
			<td>fully integrated digital widefield microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibernate E</td>
			<td>BrainBits</td>
			<td>HE500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted spinning disk confocal</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TI2-E + CSU-W1</td>
			<td>With incubator chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic devices</td>
			<td>XONA microfluidics</td>
			<td>RD450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRE</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>87917</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidics-assisted selective depolarization of axonal mitochondria

Les mitochondries sont les principaux fournisseurs d’ATP (adénosine triphosphate) dans les neurones. Le dysfonctionnement mitochondrial est un phénotype courant dans de nombreuses maladies neurodégénératives. Compte tenu de l’architecture élaborée et de la longueur extrême de certains axones, il n’est pas surprenant que les mitochondries dans les axones puissent connaître des environnements différents de ceux de leurs homologues du corps cellulaire. Fait intéressant, le dysfonctionnement des mitochondries axonales précède souvent les effets sur le corps cellulaire. Pour modéliser le dysfonctionnement mitochondrial axonal in vitro, des dispositifs microfluidiques permettent de traiter les mitochondries axonales sans affecter les mitochondries somales. Le gradient de pression fluidique dans ces chambres empêche la diffusion des molécules contre le gradient, permettant ainsi l’analyse des propriétés mitochondriales en réponse aux défis pharmacologiques locaux au sein des axones. Le protocole actuel décrit l’ensemencement des neurones dissociés de l’hippocampe dans des dispositifs microfluidiques, la coloration avec un colorant sensible au potentiel membranaire, le traitement avec une toxine mitochondriale et l’analyse microscopique subséquente. Cette méthode polyvalente pour étudier la biologie axonale peut être appliquée à de nombreuses perturbations pharmacologiques et lectures d’imagerie, et convient à plusieurs sous-types neuronaux.

Les neurones primaires de l’hippocampe ont été cultivés dans des dispositifs microfluidiques pendant 7 à 8 jours avant que les mitochondries ne soient colorées avec le colorant sensible à la membrane (TMRE) pendant 25 minutes dans les deux canaux. Comme le montre la figure 2A, cela a donné une coloration homogène des mitochondries des deux côtés des microrainures, mais elle était insuffisante pour équilibrer la coloration au milieu des microrainures. Lors de l’ajout de l’an...

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Microfluidics-Assisted Selective Depolarization of Axonal Mitochondria

Le présent protocole décrit l’ensemencement et la coloration des mitochondries neuronales dans des chambres microfluidiques. Le gradient de pression fluidique dans ces chambres permet le traitement sélectif des mitochondries dans les axones pour analyser leurs propriétés en réponse à des défis pharmacologiques sans affecter le compartiment du corps cellulaire.

Dépolarisation sélective des mitochondries axonales assistée par microfluidique

Mitochondria are the primary suppliers of ATP (adenosine triphosphate) in neurons. Mitochondrial dysfunction is a common phenotype in many ...

Les mitochondries sont essentielles à la santé neuronale. Dans de nombreuses maladies neurodégénératives, les mitochondries axonales sont les premières à en souffrir, mais on ne sait pas ce qui rend les mitochondries axonales si spéciales. Le gradient de pression fluidique dans les chambres utilisées dans ce protocole permet le traitement sélectif des axones mitochondriaux.Cela laisse les processus du corps cellulaire intacts et nous permet de nous concentrer sur la biologie axonale. Nous montrons ici la dépolarisation des mitochondries avec un colorant sensible au potentiel membranaire, mais cette méthode peut être appliquée à de nombreux types de cellules neuronales et à des lectures fluorescentes. Pour commencer, placez les six plaques de puits codées dans une hotte stérile et lavez-les deux fois avec de l’eau distillée double stérile.Laissez les plaques sécher en position inclinée pendant trois à cinq minutes. Éliminer l’excès d’eau par aspiration sous vide ou pipetage. Faites ensuite tremper la chambre microfluidique dans de l’éthanol à 80%.Encore une fois, séchez la chambre microfluidique pendant trois à cinq minutes en position inclinée et retirez l’excès d’éthanol avec un embout de pipette. Lorsqu’il est complètement sec, placez la chambre microfluidique au centre du puits et de la plaque. Tapotez doucement la chambre microfluidique à ses bordures et la section microrainure au milieu pour une fixation appropriée à la plaque de verre.Tout d’abord, collectez le nombre souhaité de neurones dissociés de l’hippocampe dans un tube de réaction de 1,5 millilitre. Centrifuger le tube à 1000 fois G pendant quatre minutes à température ambiante. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans huit microlitres de milieu neurobasal B-27.Distribuez ensuite la solution cellulaire dans l’entrée du canal de la chambre microfluidique. Tapotez à l’arrière de la plaque pour faciliter l’écoulement dans le canal. À l’aide d’une pipette, aspirer toute suspension cellulaire restante à la sortie du canal.Incuber la chambre microfluidique avec des cellules pendant 15 à 20 minutes à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Ensuite, remplissez le puits axonal supérieur avec 50 microlitres de milieu neurobasal B-27 et tapotez à l’arrière de la plaque pour faciliter l’écoulement. Remplissez chaque puits du côté soma avec 150 microlitres de milieu neurobasal B-27, créant une bulle de tension sur le dessus.Remplissez également les deux puits du côté axonal avec 100 microlitres de milieu neurobasal B-27 chacun. Après sept à huit jours de culture in vitro, assurez-vous que les axones se sont développés à travers les microrainures et se sont étendus dans le compartiment axonal. Lavez l’appareil en retirant le milieu neurobasal B-27 et en ajoutant 100 microlitres de milieu d’imagerie préchauffé aux puits supérieurs des canaux axonal et soma.Laissez le fluide s’écouler vers les puits inférieurs. Retirez le milieu des puits inférieurs et tout milieu restant des puits supérieurs, et répétez avec un milieu frais, en laissant les puits vides à la fin du lavage. Ajoutez ensuite 100 microlitres de dilution TMRE nanomolaire aux puits somatiques et axonaux.Laissez le fluide s’écouler à travers les deux compartiments, jusqu’à ce qu’il y ait un volume égal dans tous les puits. Faites le plein avec le milieu contenant TMRE. Sélectionnez une région d’intérêt dans le compartiment somatique et suivez-la à travers les microsillons dans le compartiment axonal.S’assurer que les microrainures imagées dans les compartiments somatique et axonal sont adaptées les unes aux autres. Après avoir changé le nom du fichier, acquérir des images de fluorescence rouge en utilisant une excitation de 561 nanomètres et des longueurs d’onde d’émission de 625 nanomètres. Assurer une différence de volume entre les chambres soma et axonale en vérifiant la présence d’une bulle de tension du côté somatique.Retirez ensuite le milieu d’imagerie des deux puits du côté axonal, à l’exception du milieu à l’intérieur du canal. Pour induire une dépolarisation mitochondriale, ajouter 160 microlitres de 20 micromolaires d’antimycine A diluée dans le milieu d’imagerie au puits axonal supérieur. Laissez-le s’écouler à travers le canal jusqu’à ce qu’il y ait un volume égal dans les deux puits axonaux.Répétez l’imagerie, en veillant à ce que les mêmes positions soient imagées que lors de l’acquisition de la ligne de base, en identifiant les microrainures. En utilisant ce protocole, les neurones primaires de l’hippocampe ont été cultivés dans des dispositifs microfluidiques, suivis d’une coloration mitochondriale avec un colorant sensible à la membrane, TMRE. Une coloration homogène des mitochondries a été observée des deux côtés des microrainures, mais pas au milieu.Lors de l’ajout d’antimycine A à la face axonale, les mitochondries somiques ont conservé le signal TMRE, tandis que la fluorescence a été perdue de l’axonal Mitochondries Assurez-vous qu’il ne reste pas d’humidité dans le puits ou sur l’appareil avant d’assembler l’appareil. Sinon, les chambres ne seront pas scellées. En utilisant cette méthode, nous pouvons étudier les effets de la perte de la fonction mitochondriale dans l’axone et les fonctions locales, ainsi que son influence sur la signalisation rétrograde et la survie cellulaire globale.On a longtemps pensé que la biogenèse mitochondriale se produisait exclusivement dans le corps cellulaire. Cette méthode nous a permis de révéler que les dommages aux mitochondries axonales nécessitaient une traduction locale du court de la protéine PINK1.

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