Name: microfluidics-assisted selective depolarization of axonal mitochondria
Uploaded: 2022-08-04T14:15:00
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Diese Studie wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (HA 7728/2-1 und EXC2145 Project ID 390857198) und der Max-Planck-Gesellschaft unterstützt.

Alle Tierversuche wurden nach den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften der Regierung von Oberbayern durchgeführt. Die primären Neuronen wurden aus E16.5 C57BL/6 Wildtyp-Mausembryonen beiderlei Geschlechts nach Standardmethoden wie zuvor beschrieben hergestellt6.
1. Montage der mikrofluidischen Vorrichtung
<ol><li>Beschichten Sie eine Gewebekulturplatte mit sechs Vertiefungen auf dem Glasboden mit einer Endkonzentration von 20 μg/ml Poly-D-Ly...

<ol>
	<li>Murali Mahadevan, H., Hashemiaghdam, A., Ashrafi, G., Harbauer, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+neuronal+health:+from+energy+metabolism+to+Parkinson's+disease.">Mitochondria in neuronal health: from energy metabolism to Parkinson's disease.</a> Advanced Biology. 5 (9), 2100663 (2021).</li><li>Dauer, W., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease:+mechanisms+and+models.">Parkinson's disease: mechanisms and models.</a> Neuron. 39 (6), 889-909 (2003).</li><li>Moratalla, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+vulnerability+of+primate+caudate-putamen+and+striosome-matrix+dopamine+systems+to+the+neurotoxic+effects+of+1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-+tetrahydropyridine.">Differential vulnerability of primate caudate-putamen and striosome-matrix dopamine systems to the neurotoxic effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- tetrahydropyridine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (9), 3859-3863 (1992).</li><li>Cheng, H. -. C., Ulane, C. M., Burke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+progression+in+Parkinson+disease+and+the+neurobiology+of+axons.">Clinical progression in Parkinson disease and the neurobiology of axons.</a> Annals of Neurology. 67 (6), 715-725 (2010).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury,+regeneration+and+transport.">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).</li><li>Harbauer, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+mitochondria+transport+Pink1+mRNA+via+synaptojanin+2+to+support+local+mitophagy.">Neuronal mitochondria transport Pink1 mRNA via synaptojanin 2 to support local mitophagy.</a> Neuron. 110 (9), 1516-1531 (2022).</li><li>Ashrafi, G., Schlehe, J. S., LaVoie, M. J., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+of+damaged+mitochondria+occurs+locally+in+distal+neuronal+axons+and+requires+PINK1+and+Parkin.">Mitophagy of damaged mitochondria occurs locally in distal neuronal axons and requires PINK1 and Parkin.</a> Journal of Cell Biology. 206 (5), 655-670 (2014).</li><li>Shipman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine&#235;thanesulfonic+acid+(HEPES)+as+a+tissue+culture+buffer.">Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine&#235;thanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 130 (1), 305-310 (1969).</li><li>Harbauer, A. B., Schneider, A., Wohlleber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondria+by+single-organelle+resolution.">Analysis of mitochondria by single-organelle resolution.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 15, 1-16 (2022).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+mRNA+in+uninjured+and+regenerating+cortical+mammalian+axons.">Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (15), 4697-4707 (2009).</li><li>Altman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+TDP-43+condensates+drive+neuromuscular+junction+disruption+through+inhibition+of+local+synthesis+of+nuclear+encoded+mitochondrial+proteins.">Axonal TDP-43 condensates drive neuromuscular junction disruption through inhibition of local synthesis of nuclear encoded mitochondrial proteins.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).</li></ol>

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zur Aussaat und Kultur dissoziierter Hippocampus-Neuronen in einem mikrofluidischen Gerät, um axonale Mitochondrien separat zu behandeln. Der Nutzen dieses Ansatzes mit dem membransensitiven Farbstoff TMRE und dem Komplex-III-Inhibitor Antimycin A (wie zuvor gezeigt7) wird hier demonstriert, aber diese Methode kann leicht an andere mitochondriale Farbstoffe oder genetisch kodierte Sensoren mitochondrialer Funktionen angepasst werden, die lokale, m...

Mitochondrien sind die Hauptlieferanten von ATP (Adenosintriphosphat) in Neuronen. Da die neuronale Gesundheit eng mit der mitochondrialen Funktion verbunden ist, ist es nicht verwunderlich, dass eine dysfunktionale Regulation dieser Organellen mit dem Auftreten verschiedener neurodegenerativer Erkrankungen, einschließlich der Parkinson-Krankheit1, in Verbindung gebracht wurde. Darüber hinaus wurde die mitochondriale Intoxikation erfolgreich eingesetzt, um Parkinson-Symptome bei Tieren zu modellieren2. Sowohl in Tiermodellen als auch bei menschlichen Krankheiten beginnt der Absterben von Neuronen an den distalen Teilen 3,4, was darauf hindeutet, dass axonale Mitochondrien anfälliger für Beleidigungen sein könnten. Die Biologie der Mitochondrien in Axonen ist jedoch aufgrund der Schwierigkeiten, die mit einer gezielten Behandlung und Analyse axonaler Mitochondrien bei gleichzeitiger Störung der Zellkörperprozesse verbunden sind, nicht gut verstanden.
Jüngste Fortschritte bei der Kultivierung von dissoziierten Neuronen in vitro ermöglichen nun die fluidische Trennung von Axonen und Zellkörpern durch mikrofluidische Geräte5. Wie in Abbildung 1A dargestellt, verfügen diese Geräte über vier Zugangsmulden (a/h und c/i), wobei zwei Kanäle jedes Paar (d und f) verbinden. Die großen Kanäle sind durch eine Reihe von 450 μm langen Mikrokanälen miteinander verbunden (e). Absichtliche Unterschiede in den Füllständen zwischen den beiden Kammern erzeugen einen Flüssigkeitsdruckgradienten (Abbildung 1B), der die Diffusion kleiner Moleküle aus dem Kanal mit einem niedrigeren Flüssigkeitsspiegel auf die andere Seite verhindert (Abbildung 1C, dargestellt mit Trypanblau-Farbstoff).
Wir haben kürzlich mikrofluidische Geräte verwendet, um lokale Translationsanforderungen in der axonalen Mitophagie, der selektiven Entfernung beschädigter Mitochondrien, zu untersuchen6. Im vorliegenden Protokoll werden verschiedene Schritte vorgestellt, um lokale mitochondriale Schäden durch selektive Behandlung von Axonen unter Verwendung des mitochondrialen Komplex-III-Inhibitors Antimycin A 6,7 zu induzieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well Glass bottom plate</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06.1.5H-N</td>
			<td>Silicone device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS M5000 widefield microscope</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td>EVOS M5000</td>
			<td>fully integrated digital widefield microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibernate E</td>
			<td>BrainBits</td>
			<td>HE500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted spinning disk confocal</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TI2-E + CSU-W1</td>
			<td>With incubator chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic devices</td>
			<td>XONA microfluidics</td>
			<td>RD450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRE</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>87917</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidics-assisted selective depolarization of axonal mitochondria

Mitochondrien sind die Hauptlieferanten von ATP (Adenosintriphosphat) in Neuronen. Mitochondriale Dysfunktion ist ein häufiger Phänotyp bei vielen neurodegenerativen Erkrankungen. Angesichts der ausgeklügelten Architektur und extremen Länge einiger Axone ist es nicht verwunderlich, dass Mitochondrien in Axonen andere Umgebungen erfahren können als ihre Zellkörper-Gegenstücke. Interessanterweise geht die Dysfunktion der axonalen Mitochondrien oft Auswirkungen auf den Zellkörper voraus. Um axonale mitochondriale Dysfunktion in vitro zu modellieren, ermöglichen mikrofluidische Geräte die Behandlung von axonalen Mitochondrien, ohne die somalen Mitochondrien zu beeinflussen. Der fluidische Druckgradient in diesen Kammern verhindert die Diffusion von Molekülen gegen den Gradienten und ermöglicht so die Analyse der mitochondrialen Eigenschaften als Reaktion auf lokale pharmakologische Herausforderungen innerhalb von Axonen. Das aktuelle Protokoll beschreibt die Aussaat von dissoziierten Hippocampus-Neuronen in mikrofluidischen Geräten, die Färbung mit einem membranpotentialempfindlichen Farbstoff, die Behandlung mit einem mitochondrialen Toxin und die anschließende mikroskopische Analyse. Diese vielseitige Methode zur Untersuchung der axonalen Biologie kann auf viele pharmakologische Störungen und bildgebende Auslesungen angewendet werden und eignet sich für mehrere neuronale Subtypen.

Primäre Hippocampus-Neuronen wurden 7-8 Tage lang in mikrofluidischen Geräten gezüchtet, bevor die Mitochondrien 25 Minuten lang in beiden Kanälen mit dem membransensitiven Farbstoff (TMRE) angefärbt wurden. Wie in Abbildung 2A gezeigt, ergab dies eine homogene Färbung der Mitochondrien auf beiden Seiten der Mikrorillen, reichte jedoch nicht aus, um die Färbung in die Mitte der Mikrorillen auszugleichen. Bei Zugabe von Antimycin A auf der axonalen Seite behielten die somalen Mitochond...

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Microfluidics-Assisted Selective Depolarization of Axonal Mitochondria

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Aussaat und Färbung neuronaler Mitochondrien in mikrofluidischen Kammern. Der fluidische Druckgradient in diesen Kammern ermöglicht die selektive Behandlung von Mitochondrien in Axonen, um ihre Eigenschaften als Reaktion auf pharmakologische Herausforderungen zu analysieren, ohne das Zellkörperkompartiment zu beeinträchtigen.

Mikrofluidik-unterstützte selektive Depolarisation axonaler Mitochondrien

Mitochondria are the primary suppliers of ATP (adenosine triphosphate) in neurons. Mitochondrial dysfunction is a common phenotype in many ...

Mitochondrien sind essentiell für die neuronale Gesundheit. Bei vielen neurodegenerativen Erkrankungen sind axonale Mitochondrien die ersten, die leiden, aber es ist nicht klar, was axonale Mitochondrien so besonders macht. Der fluidische Druckgradient in den in diesem Protokoll verwendeten Kammern ermöglicht die selektive Behandlung von Mitochondrienaxonen.Dadurch bleiben die Prozesse des Zellkörpers ungestört und wir können uns auf die axonale Biologie konzentrieren. Wir zeigen hier die Depolarisation von Mitochondrien mit einem membranpotentialempfindlichen Farbstoff, aber diese Methode kann auf viele verschiedene neuronale Zelltypen und Fluoreszenzanzeigen angewendet werden. Legen Sie zunächst die codierten sechs Brunnenplatten in eine sterile Haube und waschen Sie sie zweimal mit sterilem doppelt destilliertem Wasser.Lassen Sie die Platten drei bis fünf Minuten in geneigter Position trocknen. Entfernen Sie überschüssiges Wasser durch Vakuumsaugen oder Pipettieren. Dann die mikrofluidische Kammer in 80% Ethanol einweichen.Trocknen Sie die mikrofluidische Kammer erneut drei bis fünf Minuten in einer geneigten Position und entfernen Sie überschüssiges Ethanol mit einer Pipettenspitze. Wenn sie vollständig trocken ist, platzieren Sie die mikrofluidische Kammer in der Mitte des Vertiefungs und der Platte. Klopfen Sie vorsichtig auf die mikrofluidische Kammer an ihren Rändern und den Mikronutabschnitt in der Mitte, um sie ordnungsgemäß an der Glasplatte zu befestigen.Sammeln Sie zunächst die gewünschte Anzahl dissoziierter Hippocampus-Neuronen in einem 1,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 1000 mal G für vier Minuten bei Raumtemperatur. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in acht Mikrolitern B-27 Neuro-Basalmedien.Anschließend wird die Zelllösung in den Kanaleingang der mikrofluidischen Kammer dosiert. Tippen Sie auf die Rückseite der Platte, um den Fluss durch den Kanal zu unterstützen. Asspirieren Sie mit einer Pipette die verbleibende Zellsuspension am Ausgang des Kanals.Inkubieren Sie die mikrofluidische Kammer mit Zellen für 15 bis 20 Minuten bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Als nächstes füllen Sie die obere axonale Vertiefung mit 50 Mikrolitern neurobasalem B-27-Medium und klopfen Sie auf die Rückseite der Platte, um den Fluss zu unterstützen. Füllen Sie jede Vertiefung auf der Soma-Seite mit 150 Mikrolitern B-27 neurobasaler Medien, wodurch oben eine Spannungsblase entsteht.Füllen Sie auch beide Vertiefungen der axonalen Seite mit jeweils 100 Mikrolitern B-27 neurobasaler Medien. Stellen Sie nach sieben bis acht Tagen In-vitro-Kultur sicher, dass die Axone durch die Mikrorillen gewachsen sind und sich in das axonale Kompartiment ausgedehnt haben. Waschen Sie das Gerät, indem Sie das neurobasale Medium B-27 entfernen und 100 Mikroliter vorgewärmtes Bildmedium in die oberen Vertiefungen des axonalen und des Somakanals geben.Lassen Sie das Medium zu den unteren Vertiefungen durchfließen. Entfernen Sie das Medium aus den unteren Vertiefungen und das übrig gebliebene Medium aus den oberen Vertiefungen und wiederholen Sie den Vorgang mit frischem Medium, wobei die Vertiefungen am Ende der Wäsche leer bleiben. Dann fügen Sie 100 Mikroliter fünf nanomolare TMRE-Verdünnung sowohl in die somatischen als auch in die axonalen oberen Vertiefungen hinzu.Lassen Sie das Medium durch beide Kompartimente fließen, bis in allen Vertiefungen ein gleiches Volumen vorhanden ist. Füllen Sie das TMRE-haltige Medium auf. Wählen Sie eine Region von Interesse im somatischen Kompartiment und folgen Sie ihr durch die Mikrorillen in das axonale Kompartiment.Stellen Sie sicher, dass die in den somatischen und axonalen Kompartimenten abgebildeten Mikrorillen aufeinander abgestimmt sind. Nachdem Sie den Dateinamen geändert haben, erfassen Sie rote Fluoreszenzbilder mit 561 Nanometern Anregung und 625 Nanometer Emissionswellenlängen. Stellen Sie einen Volumenunterschied zwischen den Soma- und Axonalkammern sicher, indem Sie das Vorhandensein einer Spannungsblase auf der somatischen Seite überprüfen.Entfernen Sie dann das Bildmedium aus beiden Vertiefungen der axonalen Seite, mit Ausnahme des Mediums innerhalb des Kanals. Um eine mitochondriale Depolarisation zu induzieren, fügen Sie 160 Mikroliter 20 Mikromolar Antimycin A, verdünnt im Bildmedium in die obere axonale Vertiefung. Lassen Sie es durch den Kanal fließen, bis in beiden axonalen Vertiefungen ein gleiches Volumen vorhanden ist.Wiederholen Sie die Bildgebung und stellen Sie sicher, dass die gleichen Positionen wie bei der Baseline-Aufnahme abgebildet werden, indem Sie die Mikrorillen identifizieren. Mit diesem Protokoll wurden primäre Hippocampus-Neuronen in mikrofluidischen Geräten gezüchtet, gefolgt von einer mitochondrialen Färbung mit einem membranempfindlichen Farbstoff, TMRE. Eine homogene Färbung der Mitochondrien wurde auf beiden Seiten der Mikrorillen beobachtet, jedoch nicht in der Mitte.Bei Zugabe von Antimycin A auf der axonalen Seite behielten die somalen Mitochondrien das TMRE-Signal bei, während die Fluoreszenz von den axonalen Mitochondrien verloren ging Stellen Sie sicher, dass keine Feuchtigkeit im Brunnen oder auf dem Gerät zurückbleibt, bevor Sie das Gerät zusammenbauen. Andernfalls werden die Kammern nicht versiegelt. Mit dieser Methode können wir die Auswirkungen des Verlusts der mitochondrialen Funktion im Axon und in lokalen Funktionen sowie deren Einfluss auf die retrograde Signalübertragung und das globale Zellüberleben untersuchen.Lange Zeit wurde angenommen, dass die mitochondriale Biogenese ausschließlich im Zellkörper stattfindet. Diese Methode ermöglichte es uns, zu zeigen, dass die Schädigung der axonalen Mitochondrien eine lokale Translation des Proteins PINK1 erfordert.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Mechanische Manipulation von Neuronen zu Axonal Entwicklungssteuerung

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Forschung

Neurowissenschaften

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to a limited extent after ...

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Elektroporation des Hinterhirn zu Axonal Trajectories und Synaptic Treffer in der Embryo-Küken Trace

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Echtzeit-Bildgebung des axonalen Transport von Quantum Dot-markierten BDNF in primären Neuronen

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