Name: microfluidics-assisted selective depolarization of axonal mitochondria
Uploaded: 2022-08-04T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidics-Assisted Selective Depolarization of Axonal Mitochondria at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי קרן המחקר הגרמנית (HA 7728/2-1 ו- EXC2145 Project ID 390857198) ואגודת מקס פלנק.

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות הרלוונטיות של ממשלת בוואריה עילית. הנוירונים הראשוניים הוכנו מעוברי עכברים מסוג E16.5 C57BL/6 משני המינים בשיטות סטנדרטיות כפי שתואר קודםלכן 6.
1. הרכבה של המכשיר המיקרופלואידי
<ol><li>מצפים צלחת תרבית רקמה א...

<ol>
	<li>Murali Mahadevan, H., Hashemiaghdam, A., Ashrafi, G., Harbauer, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+neuronal+health:+from+energy+metabolism+to+Parkinson's+disease.">Mitochondria in neuronal health: from energy metabolism to Parkinson's disease.</a> Advanced Biology. 5 (9), 2100663 (2021).</li><li>Dauer, W., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease:+mechanisms+and+models.">Parkinson's disease: mechanisms and models.</a> Neuron. 39 (6), 889-909 (2003).</li><li>Moratalla, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+vulnerability+of+primate+caudate-putamen+and+striosome-matrix+dopamine+systems+to+the+neurotoxic+effects+of+1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-+tetrahydropyridine.">Differential vulnerability of primate caudate-putamen and striosome-matrix dopamine systems to the neurotoxic effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- tetrahydropyridine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (9), 3859-3863 (1992).</li><li>Cheng, H. -. C., Ulane, C. M., Burke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+progression+in+Parkinson+disease+and+the+neurobiology+of+axons.">Clinical progression in Parkinson disease and the neurobiology of axons.</a> Annals of Neurology. 67 (6), 715-725 (2010).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury,+regeneration+and+transport.">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).</li><li>Harbauer, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+mitochondria+transport+Pink1+mRNA+via+synaptojanin+2+to+support+local+mitophagy.">Neuronal mitochondria transport Pink1 mRNA via synaptojanin 2 to support local mitophagy.</a> Neuron. 110 (9), 1516-1531 (2022).</li><li>Ashrafi, G., Schlehe, J. S., LaVoie, M. J., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+of+damaged+mitochondria+occurs+locally+in+distal+neuronal+axons+and+requires+PINK1+and+Parkin.">Mitophagy of damaged mitochondria occurs locally in distal neuronal axons and requires PINK1 and Parkin.</a> Journal of Cell Biology. 206 (5), 655-670 (2014).</li><li>Shipman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine&#235;thanesulfonic+acid+(HEPES)+as+a+tissue+culture+buffer.">Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine&#235;thanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 130 (1), 305-310 (1969).</li><li>Harbauer, A. B., Schneider, A., Wohlleber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondria+by+single-organelle+resolution.">Analysis of mitochondria by single-organelle resolution.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 15, 1-16 (2022).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+mRNA+in+uninjured+and+regenerating+cortical+mammalian+axons.">Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (15), 4697-4707 (2009).</li><li>Altman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+TDP-43+condensates+drive+neuromuscular+junction+disruption+through+inhibition+of+local+synthesis+of+nuclear+encoded+mitochondrial+proteins.">Axonal TDP-43 condensates drive neuromuscular junction disruption through inhibition of local synthesis of nuclear encoded mitochondrial proteins.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).</li></ol>

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לזרוע ולתרבת נוירונים מנותקים בהיפוקמפוס במכשיר מיקרופלואידי לטיפול במיטוכונדריה אקסונאלית בנפרד. התועלת של גישה זו עם הצבע הרגיש לממברנה TMRE ומעכב III המורכב Antimycin A (כפי שהוכח בעבר7) מודגמת כאן, אך ניתן להתאים שיטה זו בקלות לצבעים מיטוכונדריאליים אח...

מיטוכונדריה הם הספקים העיקריים של ATP (אדנוזין טריפוספט) בתאי עצב. מכיוון שבריאות עצבית קשורה קשר הדוק לתפקוד המיטוכונדריה, אין זה מפתיע כי ויסות לא מתפקד של אברונים אלה נקשר עם הופעת מחלות נוירודגנרטיביות שונות, כולל מחלת פרקינסון1. יתר על כן, שיכרון מיטוכונדריאלי שימש בהצלחה למודל תסמיני פרקינסון בבעלי חיים2. הן במודלים של בעלי חיים והן במחלות אנושיות, מותם של תאי עצב מתחיל בחלקים הדיסטליים 3,4, מה שמרמז על כך שהמיטוכונדריה האקסונלית עשויה להיות רגישה יותר לעלבונות. עם זאת, הביולוגיה של המיטוכונדריה באקסונים אינה מובנת היטב בשל הקשיים הקשורים לטיפול ממוקד וניתוח של מיטוכונדריה אקסונאלית ללא הפרעה בו זמנית של תהליכים בגוף התא.
ההתקדמות האחרונה בטכניקות culturing של נוירונים מנותקים במבחנה מאפשרת כעת הפרדה נוזלית של אקסונים וגופי תאים באמצעות התקנים מיקרופלואידיים5. כפי שמתואר באיור 1A, המכשירים האלה כוללים ארבע בארות גישה (a/h ו-c/i), עם שני ערוצים המחברים כל זוג (d ו-f). הערוצים הגדולים מחוברים זה לזה בסדרה של מיקרו-ערוצים באורך 450 מיקרומטר (e). הבדלים מכוונים ברמות המילוי בין שני התאים יוצרים שיפוע לחץ נוזל (איור 1B) שמונע דיפוזיה של מולקולות קטנות מהתעלה עם רמת נוזל נמוכה יותר לצד השני (איור 1C, מודגם בצבע כחול טריפאן).
לאחרונה השתמשנו בהתקנים מיקרופלואידיים כדי לחקור את דרישות התרגום המקומיות במיטופגיה אקסונאלית, הסרה סלקטיבית של מיטוכונדריה פגומה6. בפרוטוקול הנוכחי מוצגים צעדים שונים לגרימת נזק מיטוכונדריאלי מקומי באמצעות טיפול סלקטיבי באקסונים באמצעות מעכב קומפלקס מיטוכונדריאלי III Antimycin A 6,7.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well Glass bottom plate</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06.1.5H-N</td>
			<td>Silicone device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS M5000 widefield microscope</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td>EVOS M5000</td>
			<td>fully integrated digital widefield microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibernate E</td>
			<td>BrainBits</td>
			<td>HE500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted spinning disk confocal</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TI2-E + CSU-W1</td>
			<td>With incubator chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic devices</td>
			<td>XONA microfluidics</td>
			<td>RD450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRE</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>87917</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidics-assisted selective depolarization of axonal mitochondria

מיטוכונדריה הם הספקים העיקריים של ATP (אדנוזין טריפוספט) בתאי עצב. תפקוד לקוי של המיטוכונדריה הוא פנוטיפ נפוץ במחלות נוירודגנרטיביות רבות. בהתחשב בארכיטקטורה המשוכללת ובאורך הקיצוני של חלק מהאקסונים, אין זה מפתיע שהמיטוכונדריה באקסונים יכולה לחוות סביבות שונות בהשוואה למקביליהם בגוף התא. באופן מעניין, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה האקסונלית לעתים קרובות קודם להשפעות על גוף התא. כדי ליצור מודלים של תפקוד לקוי של המיטוכונדריה במבחנה, התקנים מיקרופלואידיים מאפשרים טיפול במיטוכונדריה אקסונאלית מבלי להשפיע על המיטוכונדריה הסומאלית. שיפוע הלחץ הנוזלי בתאים אלה מונע דיפוזיה של מולקולות כנגד השיפוע, ובכך מאפשר ניתוח של תכונות המיטוכונדריה בתגובה לאתגרים פרמקולוגיים מקומיים בתוך האקסונים. הפרוטוקול הנוכחי מתאר זריעה של נוירונים מנותקים בהיפוקמפוס במכשירים מיקרופלואידיים, הכתמה בצבע רגיש פוטנציאלי לממברנה, טיפול ברעלן מיטוכונדריאלי, והניתוח המיקרוסקופי שלאחר מכן. שיטה רב-תכליתית זו לחקר הביולוגיה האקסונאלית יכולה להיות מיושמת על הפרעות פרמקולוגיות רבות וקריאות הדמיה, והיא מתאימה למספר תת-סוגים עצביים.

נוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס גודלו במכשירים מיקרופלואידיים במשך 7-8 ימים לפני שהמיטוכונדריה הוכתמה בצבע הרגיש לממברנה (TMRE) במשך 25 דקות בשתי הערוצים. כפי שניתן לראות באיור 2A, זה הניב כתמים הומוגניים של המיטוכונדריה משני צידי המיקרו-גרובים, אך לא היה די בכך כדי לאזן את הכתמים...

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidics-Assisted Selective Depolarization of Axonal Mitochondria at JoVE.com

Microfluidics-Assisted Selective Depolarization of Axonal Mitochondria

הפרוטוקול הנוכחי מתאר זריעה והכתמה של מיטוכונדריה עצבית בתאים מיקרופלואידיים. שיפוע הלחץ הנוזלי בתאים אלה מאפשר טיפול סלקטיבי במיטוכונדריה באקסונים כדי לנתח את תכונותיהם בתגובה לאתגרים פרמקולוגיים מבלי להשפיע על תא גוף התא.

דה-פולריזציה סלקטיבית בסיוע מיקרופלואידיקה של מיטוכונדריה אקסונאלית

Mitochondria are the primary suppliers of ATP (adenosine triphosphate) in neurons. Mitochondrial dysfunction is a common phenotype in many ...

מיטוכונדריה חיונית לבריאות תאי העצב. במחלות נוירודגנרטיביות רבות, המיטוכונדריה האקסונאלית היא הראשונה שסובלת, אך לא ברור מה הופך את המיטוכונדריה האקסונלית למיוחדת כל כך. שיפוע הלחץ הנוזלי בתאים המשמשים בפרוטוקול זה מאפשר טיפול סלקטיבי באקסונים של המיטוכונדריה.זה משאיר את תהליכי הגוף התא ללא הפרעה, ומאפשר לנו להתמקד בביולוגיה אקסונאלית. אנו מראים כאן את הדה-פולריזציה של מיטוכונדריה עם צבע רגיש פוטנציאלי לממברנה, אך ניתן ליישם שיטה זו על סוגי תאים עצביים רבים ושונים, ועל קריאות פלואורסצנטיות. כדי להתחיל, הניחו את שש צלחות הבאר המקודדות במכסה מנוע סטרילי, ושטפו אותן פעמיים במים מזוקקים כפולים סטריליים.תנו לצלחות להתייבש במצב מוטה למשך שלוש עד חמש דקות. הסר עודפי מים על ידי שאיבה ואקום או פיפטציה. לאחר מכן השרו את התא המיקרופלואידי ב-80% אתנול.שוב, לייבש את החדר microfluidic במשך שלוש עד חמש דקות במצב מוטה, ולהסיר אתנול עודף עם קצה פיפטה. כאשר יבש לחלוטין, מניחים את התא המיקרופלואידי במרכז הבאר ובצלחת. הקש בעדינות על התא המיקרופלואידי בגבולותיו ועל חלק המיקרו-חריץ באמצע לחיבור תקין לצלחת הזכוכית.ראשית, אסוף את המספר הרצוי של נוירונים מנותקים בהיפוקמפוס בצינור תגובה של 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה את הצינור ב 1000 פעמים G במשך ארבע דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופר-נטנט, והניחו את הכדור בשמונה מיקרוליטרים של B-27 נוירו באזל.לאחר מכן יש לחלק את תמיסת התא לתוך פתח התעלה של החדר המיקרופלואידי. הקש על גב הלוח כדי לסייע לזרימה דרך הערוץ. באמצעות פיפטה, לשאוף כל השעיה התא הנותר ביציאה של הערוץ.דגרו את התא המיקרופלואידי עם תאים למשך 15 עד 20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני. לאחר מכן, מלאו את הבאר האקסונאלית העליונה ב-50 מיקרוליטרים של מדיה נוירובסלית B-27, והקישו על גב הצלחת כדי לסייע לזרימה. מלא כל באר בצד סומה עם 150 microliters של B-27 neurobasal מדיה, יצירת בועת מתח על גבי.כמו כן למלא את שתי הבארות של הצד האקסונאלי עם 100 microliters של B-27 neurobasal מדיה כל אחד. לאחר שבעה עד שמונה ימים של תרבית במבחנה, ודא שהאקסונים גדלו דרך המיקרו-גרובים, והתרחבו לתא האקסונאלי. שטפו את המכשיר על ידי הסרת המדיום הנוירובסאלי B-27, והוספת 100 מיקרוליטרים של מדיום הדמיה מחומם מראש לבארות העליונות של הערוצים האקסונאליים והסומא.תנו למדיום לזרום אל הבארות התחתונות. מוציאים את המדיום מהבארות התחתונות, ואת כל שאריות המדיום מהבארות העליונות, וחוזרים עם מדיום טרי, ומשאירים את הבארות ריקות בסוף הכביסה. לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטרים של חמישה דילול TMRE ננומולרי הן לבארות העליונות הסומטיות והן לבארות העליונות האקסונאליות.תן למדיום לזרום דרך שני התאים, עד שיהיה נפח שווה בכל הבארות. מלאו את המדיום המכיל TMRE. בחר אזור עניין בתא הסומטי, ועקוב אחריו דרך המיקרו-גרובים לתוך התא האקסוןאלי.ודא שהמיקרו-חריצים המצולמים בתאים הסומטיים והאקסונאליים מותאמים זה לזה. לאחר שינוי שם הקובץ, קבל תמונות פלואורסצנטיות אדומות באמצעות עירור של 561 ננומטר ואורכי גל פליטה של 625 ננומטר. ודא הפרש נפח בין התאים הסומא והאקסונאליים על ידי בדיקת נוכחות של בועת מתח בצד הסומטי.לאחר מכן הסר את מדיום ההדמיה משתי הבארות של הצד האקסונאלי, למעט המדיום בתוך הערוץ. כדי לגרום לדה-פולריזציה של המיטוכונדריה, הוסיפו 160 מיקרוליטרים של 20 מיקרומולר אנטימיצין A מדולל במדיום ההדמיה לבאר האקסונלית העליונה. תן לו לזרום דרך הערוץ עד שיש נפח שווה בשתי הבארות האקסונליות.חזור על ההדמיה, וודא שאותן עמדות מוצגות כמו במהלך הרכישה הבסיסית, על ידי זיהוי המיקרוגרובים. באמצעות פרוטוקול זה, נוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס גודלו במכשירים מיקרופלואידיים, ולאחר מכן הכתימו את המיטוכונדריה עם צבע רגיש לממברנה, TMRE. צביעה הומוגנית של המיטוכונדריה נצפתה משני צידי המיקרוגרובים, אך לא באמצע.עם הוספת אנטימיצין A לצד האקסונאלי, המיטוכונדריה הסומלית שמרה על אות ה-TMRE, בעוד שהפלואורסצנציה אבדה מהמיטוכונדריה האקסונאלית ודא שלא נותרת לחות בבאר או במכשיר לפני הרכבת המכשיר. אחרת, התאים לא יהיו אטומים. באמצעות שיטה זו אנו יכולים לחקור את ההשפעות של אובדן תפקוד מיטוכונדריאלי באקסון ובתפקודים מקומיים, כמו גם את השפעתו על איתות מדרדר והישרדות תאים גלובלית.זה זמן רב חשבו שביוגנזה מיטוכונדריאלית מתרחשת אך ורק בגוף התא. שיטה זו אפשרה לנו לגלות שפגיעה אקסונלית במיטוכונדריה דרשה תרגום מקומי של החלבון PINK1.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mechanical Manipulation of Neurons to Control Axonal Development

מניפולציה מכני של נוירונים שליטה פיתוח axonal

Cell manipulations and extension of neuronal axons can be accomplished with calibrated glass micro-fibers capable of measuring and applying forces in the ...

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

הכרומטין immunoprecipitation מרקמות השורש הגבי הגרעינים בעקבות פציעה axonal

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Electroporation של המוח האחורי כדי לעקוב אחר מסלולים ויעדי axonal Synaptic בעובר האפרוח

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

איתור סלקטיבי של סיבי עצב שמיעה בVestibulocochlear העוברי העופות

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

Electroporation תת סוג סלקטיבי של בקליפת המוח interneurons

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

הדמיה של axonal תחבורה של Quantum בזמן אמת Dot-כותרת BDNF בנוירונים העיקרי

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

Characterizing the Composition of Molecular Motors on Moving Axonal Cargo Using "Cargo Mapping" Analysis

ניתוח &quot;מטען מיפוי&quot; המאפיין את ההרכב מולקולרי מוטורס על העברת axonal מטענים שימוש

Understanding the mechanisms by which molecular motors coordinate their activities to transport vesicular cargoes within neurons requires the quantitative ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

הדמיה תלת-ממדית וניתוח של המיטוכונדריה בתוך סיבי עצב Intraepidermal אנושי

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

ניתוח של המוח המיטוכונדריה באמצעות מיקרוסקופ סידורי בלוק פן אלקטרונים סורק

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

ויזואליזציה של דפוס היטל אקסונל של נוירונים מוטוריים עובריים ב<em&gt; תסיסנית</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...