Name: microfluidics-assisted selective depolarization of axonal mitochondria
Uploaded: 2022-08-04T14:15:00
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Questo studio è stato sostenuto dalla Fondazione tedesca per la ricerca (HA 7728/2-1 e EXC2145 Project ID 390857198) e dalla Max Planck Society.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti seguendo le linee guida e i regolamenti pertinenti del governo dell'Alta Baviera. I neuroni primari sono stati preparati da E16.5 C57BL/6 embrioni di topo wild-type di entrambi i sessi seguendo metodi standard come precedentemente descritto6.
1. Assemblaggio del dispositivo microfluidico
<ol><li>Rivestire una piastra di coltura tissutale con fondo di vetro a sei pozzetti con una concentrazione fi...

<ol>
	<li>Murali Mahadevan, H., Hashemiaghdam, A., Ashrafi, G., Harbauer, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+neuronal+health:+from+energy+metabolism+to+Parkinson's+disease.">Mitochondria in neuronal health: from energy metabolism to Parkinson's disease.</a> Advanced Biology. 5 (9), 2100663 (2021).</li><li>Dauer, W., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease:+mechanisms+and+models.">Parkinson's disease: mechanisms and models.</a> Neuron. 39 (6), 889-909 (2003).</li><li>Moratalla, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+vulnerability+of+primate+caudate-putamen+and+striosome-matrix+dopamine+systems+to+the+neurotoxic+effects+of+1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-+tetrahydropyridine.">Differential vulnerability of primate caudate-putamen and striosome-matrix dopamine systems to the neurotoxic effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- tetrahydropyridine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (9), 3859-3863 (1992).</li><li>Cheng, H. -. C., Ulane, C. M., Burke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+progression+in+Parkinson+disease+and+the+neurobiology+of+axons.">Clinical progression in Parkinson disease and the neurobiology of axons.</a> Annals of Neurology. 67 (6), 715-725 (2010).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury,+regeneration+and+transport.">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).</li><li>Harbauer, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+mitochondria+transport+Pink1+mRNA+via+synaptojanin+2+to+support+local+mitophagy.">Neuronal mitochondria transport Pink1 mRNA via synaptojanin 2 to support local mitophagy.</a> Neuron. 110 (9), 1516-1531 (2022).</li><li>Ashrafi, G., Schlehe, J. S., LaVoie, M. J., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+of+damaged+mitochondria+occurs+locally+in+distal+neuronal+axons+and+requires+PINK1+and+Parkin.">Mitophagy of damaged mitochondria occurs locally in distal neuronal axons and requires PINK1 and Parkin.</a> Journal of Cell Biology. 206 (5), 655-670 (2014).</li><li>Shipman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine&#235;thanesulfonic+acid+(HEPES)+as+a+tissue+culture+buffer.">Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine&#235;thanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 130 (1), 305-310 (1969).</li><li>Harbauer, A. B., Schneider, A., Wohlleber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondria+by+single-organelle+resolution.">Analysis of mitochondria by single-organelle resolution.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 15, 1-16 (2022).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+mRNA+in+uninjured+and+regenerating+cortical+mammalian+axons.">Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (15), 4697-4707 (2009).</li><li>Altman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+TDP-43+condensates+drive+neuromuscular+junction+disruption+through+inhibition+of+local+synthesis+of+nuclear+encoded+mitochondrial+proteins.">Axonal TDP-43 condensates drive neuromuscular junction disruption through inhibition of local synthesis of nuclear encoded mitochondrial proteins.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).</li></ol>

Il presente protocollo descrive un metodo per seminare e coltivare neuroni ippocampali dissociati in un dispositivo microfluidico per trattare separatamente i mitocondri assonali. L'utilità di questo approccio con il colorante sensibile alla membrana TMRE e l'inibitore III complesso Antimicina A (come precedentemente dimostrato7) è dimostrata qui, ma questo metodo può essere facilmente adattato ad altri coloranti mitocondriali o sensori geneticamente codificati di funzioni mitocondriali che con...

I mitocondri sono i principali fornitori di ATP (adenosina trifosfato) nei neuroni. Poiché la salute neuronale è intimamente legata alla funzione mitocondriale, non sorprende che la regolazione disfunzionale di questi organelli sia stata associata all'insorgenza di varie malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Parkinson1. Inoltre, l'intossicazione mitocondriale è stata utilizzata con successo per modellare i sintomi parkinsoniani negli animali2. Sia nei modelli animali che nelle malattie umane, la scomparsa dei neuroni inizia alle parti distali3,4, suggerendo che i mitocondri assonali potrebbero essere più suscettibili agli insulti. Tuttavia, la biologia dei mitocondri negli assoni non è ben compresa a causa delle difficoltà associate al trattamento mirato e all'analisi dei mitocondri assonali senza disturbi simultanei dei processi del corpo cellulare.
I recenti progressi nelle tecniche di coltura di neuroni dissociati in vitro consentono ora la separazione fluidica di assoni e corpi cellulari attraverso dispositivi microfluidici5. Come illustrato nella Figura 1A, questi dispositivi sono dotati di quattro pozzetti di accesso (a/h e c/i), con due canali che collegano ogni coppia (d e f). I grandi canali sono collegati tra loro da una serie di microcanali lunghi 450 μm (e). Le differenze intenzionali nei livelli di riempimento tra le due camere creano un gradiente di pressione del fluido (Figura 1B) che impedisce la diffusione di piccole molecole dal canale con un livello di fluido inferiore all'altro lato (Figura 1C, illustrata con colorante blu Trypan).
Recentemente abbiamo utilizzato dispositivi microfluidici per studiare i requisiti di traduzione locale nella mitofagia assonale, la rimozione selettiva dei mitocondri danneggiati6. Nel presente protocollo, vengono presentati diversi passaggi per indurre danni mitocondriali locali attraverso il trattamento selettivo degli assoni utilizzando l'inibitore del complesso mitocondriale III Antimicina A 6,7.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well Glass bottom plate</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06.1.5H-N</td>
			<td>Silicone device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS M5000 widefield microscope</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td>EVOS M5000</td>
			<td>fully integrated digital widefield microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibernate E</td>
			<td>BrainBits</td>
			<td>HE500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted spinning disk confocal</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TI2-E + CSU-W1</td>
			<td>With incubator chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic devices</td>
			<td>XONA microfluidics</td>
			<td>RD450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRE</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>87917</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidics-assisted selective depolarization of axonal mitochondria

I mitocondri sono i principali fornitori di ATP (adenosina trifosfato) nei neuroni. La disfunzione mitocondriale è un fenotipo comune in molte malattie neurodegenerative. Data l'architettura elaborata e l'estrema lunghezza di alcuni assoni, non sorprende che i mitocondri negli assoni possano sperimentare ambienti diversi rispetto alle loro controparti del corpo cellulare. È interessante notare che la disfunzione dei mitocondri assonali spesso precede gli effetti sul corpo cellulare. Per modellare la disfunzione mitocondriale assonale in vitro, i dispositivi microfluidici consentono il trattamento dei mitocondri assonali senza influenzare i mitocondri somali. Il gradiente di pressione fluidica in queste camere impedisce la diffusione delle molecole contro il gradiente, consentendo così l'analisi delle proprietà mitocondriali in risposta alle sfide farmacologiche locali all'interno degli assoni. L'attuale protocollo descrive la semina di neuroni ippocampali dissociati in dispositivi microfluidici, la colorazione con un colorante sensibile al potenziale di membrana, il trattamento con una tossina mitocondriale e la successiva analisi microscopica. Questo metodo versatile per studiare la biologia assonale può essere applicato a molte perturbazioni farmacologiche e letture di imaging ed è adatto a diversi sottotipi neuronali.

I neuroni ippocampali primari sono stati coltivati in dispositivi microfluidici per 7-8 giorni prima che i mitocondri fossero colorati con il colorante sensibile alla membrana (TMRE) per 25 minuti in entrambi i canali. Come mostrato nella Figura 2A, questo ha prodotto una colorazione omogenea dei mitocondri su entrambi i lati dei microsolchi, ma era insufficiente per equilibrare la colorazione nel mezzo dei microsolchi. Dopo l'aggiunta di Antimicina A al lato assonale, i mitocondri somali ha...

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Microfluidics-Assisted Selective Depolarization of Axonal Mitochondria

Il presente protocollo descrive la semina e la colorazione dei mitocondri neuronali in camere microfluidiche. Il gradiente di pressione fluidica in queste camere consente il trattamento selettivo dei mitocondri negli assoni per analizzare le loro proprietà in risposta alle sfide farmacologiche senza influenzare il compartimento corporeo cellulare.

Depolarizzazione selettiva assistita da microfluidica dei mitocondri assonali

Mitochondria are the primary suppliers of ATP (adenosine triphosphate) in neurons. Mitochondrial dysfunction is a common phenotype in many ...

I mitocondri sono essenziali per la salute neuronale. In molte malattie neurodegenerative, i mitocondri assonali sono i primi a soffrire, ma non è chiaro cosa renda i mitocondri assonali così speciali. Il gradiente di pressione fluidica nelle camere utilizzate in questo protocollo consente il trattamento selettivo degli assoni dei mitocondri.Questo lascia indisturbati i processi del corpo cellulare e ci permette di concentrarci sulla biologia assonale. Mostriamo qui la depolarizzazione dei mitocondri con un colorante sensibile al potenziale di membrana, ma questo metodo può essere applicato a molti diversi tipi di cellule neuronali e letture fluorescenti. Per iniziare, posizionare le sei piastre codificate in un cappuccio sterile e lavarle due volte con acqua distillata doppia sterile.Lasciare asciugare le piastre in posizione inclinata per tre-cinque minuti. Rimuovere l'acqua in eccesso mediante aspirazione sottovuoto o pipettaggio. Quindi immergere la camera microfluidica in etanolo all'80%.Anche in questo caso, asciugare la camera microfluidica per tre-cinque minuti in posizione inclinata e rimuovere l'etanolo in eccesso con una punta di pipetta. Una volta completamente asciutta, posizionare la camera microfluidica al centro del pozzetto e della piastra. Picchiettare delicatamente la camera microfluidica ai bordi e la sezione microsolco al centro per un corretto fissaggio alla lastra di vetro.In primo luogo, raccogliere il numero desiderato di neuroni ippocampali dissociati in un tubo di reazione da 1,5 millilitri. Centrifugare il tubo a 1000 volte G per quattro minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in otto microlitri di mezzi neuro basali B-27.Quindi erogare la soluzione cellulare nell'ingresso del canale della camera microfluidica. Toccare sul retro della piastra per facilitare il flusso attraverso il canale. Utilizzando una pipetta, aspirare eventuali sospensioni cellulari residue all'uscita del canale.Incubare la camera microfluidica con cellule per 15-20 minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Quindi, riempire il pozzetto assonale superiore con 50 microlitri di mezzi neurobasali B-27 e toccare il retro della piastra per aiutare il flusso. Riempire ogni pozzetto sul lato soma con 150 microlitri di mezzi neurobasali B-27, creando una bolla di tensione sulla parte superiore.Riempire anche entrambi i pozzetti del lato assonale con 100 microlitri di mezzi neurobasali B-27 ciascuno. Dopo sette-otto giorni di coltura in vitro, assicurarsi che gli assoni siano cresciuti attraverso i microsolchi e si siano estesi nel compartimento assonale. Lavare il dispositivo rimuovendo il mezzo neurobasale B-27 e aggiungendo 100 microlitri di mezzo di imaging preriscaldato ai pozzetti superiori di entrambi i canali assonale e soma.Lascia che il mezzo fluisca attraverso i pozzi inferiori. Rimuovere il mezzo dai pozzetti inferiori e qualsiasi mezzo rimanente dai pozzetti superiori e ripetere con il terreno fresco, lasciando i pozzetti vuoti alla fine del lavaggio. Quindi aggiungere 100 microlitri di diluizione TMRE nanomolare sia al pozzetto somatico che a quello assonale.Lascia che il mezzo scorra attraverso entrambi i compartimenti, fino a quando non c'è un volume uguale in tutti i pozzi. Riempire con il supporto contenente TMRE. Seleziona una regione di interesse nel compartimento somatico e seguila attraverso i microsolchi nel compartimento assonale.Assicurarsi che le micro scanalature riprodotte nei compartimenti somatico e assonale siano abbinate tra loro. Dopo aver modificato il nome del file, acquisire immagini a fluorescenza rossa utilizzando lunghezze d'onda di eccitazione di 561 nanometri e lunghezze d'onda di emissione di 625 nanometri. Garantire una differenza di volume tra le camere soma e assonale controllando la presenza di una bolla di tensione sul lato somatico.Quindi rimuovere il mezzo di imaging da entrambi i pozzetti del lato assonale, ad eccezione del mezzo all'interno del canale. Per indurre la depolarizzazione mitocondriale, aggiungere 160 microlitri di 20 micromolari antimicina A diluiti nel mezzo di imaging al pozzetto assonale superiore. Lascia che fluisca attraverso il canale fino a quando non c'è un volume uguale in entrambi i pozzetti assonali.Ripetere l'imaging, assicurandosi che vengano visualizzate le stesse posizioni di durante l'acquisizione della linea di base, identificando i microsolchi. Utilizzando questo protocollo, i neuroni ippocampali primari sono stati coltivati in dispositivi microfluidici, seguiti dalla colorazione mitocondriale con un colorante sensibile alla membrana, TMRE. La colorazione omogenea dei mitocondri è stata osservata su entrambi i lati dei microsolchi, ma non nel mezzo.Dopo l'aggiunta di antimicina A al lato assonale, i mitocondri somali hanno mantenuto il segnale TMRE, mentre la fluorescenza è stata persa dai mitocondri assonali Assicurarsi che non rimanga umidità nel pozzetto o sul dispositivo prima di assemblare il dispositivo. In caso contrario, le camere non saranno sigillate. Usando questo metodo, possiamo studiare gli effetti della perdita della funzione mitocondriale nell'assone e nelle funzioni locali, nonché la sua influenza sulla segnalazione retrograda e sulla sopravvivenza cellulare globale.Si è pensato a lungo che la biogenesi mitocondriale avvenisse esclusivamente nel corpo cellulare. Questo metodo ci ha permesso di rivelare che il danno mitocondriale assonale richiedeva la traduzione locale del corto di proteina PINK1.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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