Name: microfluidics-assisted selective depolarization of axonal mitochondria
Uploaded: 2022-08-04T14:15:00
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この研究は、ドイツ研究財団(HA 7728/2-1およびEXC2145プロジェクトID 390857198)およびマックスプランク協会の支援を受けました。

すべての動物実験は、オーバーバイエルン州の関連するガイドラインと規制に従って実施されました。初代ニューロンは、前述の標準的な方法に従って、両性のE16.5 C57BL/6野生型マウス胚から調製した6。
1. マイクロ流体デバイスの組み立て
<ol><li>1枚の6ウェルガラス底組織培養プレートに、最終濃度20 μg/mLのポリ-D-リジンと3.4 μg/mLのラミ?...

<ol>
	<li>Murali Mahadevan, H., Hashemiaghdam, A., Ashrafi, G., Harbauer, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+neuronal+health:+from+energy+metabolism+to+Parkinson's+disease.">Mitochondria in neuronal health: from energy metabolism to Parkinson's disease.</a> Advanced Biology. 5 (9), 2100663 (2021).</li><li>Dauer, W., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease:+mechanisms+and+models.">Parkinson's disease: mechanisms and models.</a> Neuron. 39 (6), 889-909 (2003).</li><li>Moratalla, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+vulnerability+of+primate+caudate-putamen+and+striosome-matrix+dopamine+systems+to+the+neurotoxic+effects+of+1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-+tetrahydropyridine.">Differential vulnerability of primate caudate-putamen and striosome-matrix dopamine systems to the neurotoxic effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- tetrahydropyridine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (9), 3859-3863 (1992).</li><li>Cheng, H. -. C., Ulane, C. M., Burke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+progression+in+Parkinson+disease+and+the+neurobiology+of+axons.">Clinical progression in Parkinson disease and the neurobiology of axons.</a> Annals of Neurology. 67 (6), 715-725 (2010).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury,+regeneration+and+transport.">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).</li><li>Harbauer, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+mitochondria+transport+Pink1+mRNA+via+synaptojanin+2+to+support+local+mitophagy.">Neuronal mitochondria transport Pink1 mRNA via synaptojanin 2 to support local mitophagy.</a> Neuron. 110 (9), 1516-1531 (2022).</li><li>Ashrafi, G., Schlehe, J. S., LaVoie, M. J., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+of+damaged+mitochondria+occurs+locally+in+distal+neuronal+axons+and+requires+PINK1+and+Parkin.">Mitophagy of damaged mitochondria occurs locally in distal neuronal axons and requires PINK1 and Parkin.</a> Journal of Cell Biology. 206 (5), 655-670 (2014).</li><li>Shipman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine&#235;thanesulfonic+acid+(HEPES)+as+a+tissue+culture+buffer.">Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine&#235;thanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 130 (1), 305-310 (1969).</li><li>Harbauer, A. B., Schneider, A., Wohlleber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondria+by+single-organelle+resolution.">Analysis of mitochondria by single-organelle resolution.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 15, 1-16 (2022).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+mRNA+in+uninjured+and+regenerating+cortical+mammalian+axons.">Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (15), 4697-4707 (2009).</li><li>Altman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+TDP-43+condensates+drive+neuromuscular+junction+disruption+through+inhibition+of+local+synthesis+of+nuclear+encoded+mitochondrial+proteins.">Axonal TDP-43 condensates drive neuromuscular junction disruption through inhibition of local synthesis of nuclear encoded mitochondrial proteins.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).</li></ol>

本プロトコルは、軸索ミトコンドリアを別々に治療するためにマイクロ流体デバイス内で解離した海馬ニューロンを播種および培養する方法を記載する。膜感受性色素TMREと複合体III阻害剤Antimycin A(以前に実証された7)を用いたこのアプローチの有用性はここで実証されていますが、この方法は、局所的な顕微鏡ベースの読み出しを可能にする他のミトコンドリア色素またはミトコンドリア機?...

ミトコンドリアは、ニューロンにおけるATP(アデノシン三リン酸)の主要な供給者です。神経細胞の健康はミトコンドリア機能と密接に関連しているため、これらの細胞小器官の機能不全の調節がパーキンソン病を含むさまざまな神経変性疾患の発症に関連していることは驚くべきことではありません1。さらに、ミトコンドリア中毒は、動物のパーキンソン病症状をモデル化するために首尾よく使用されています2。動物モデルとヒト疾患の両方で、ニューロンの終焉は遠位部3,4から始まり、軸索ミトコンドリアが侮辱を受けやすい可能性があることを示唆しています。しかし、軸索におけるミトコンドリアの生物学は、細胞体突起の同時障害なしに軸索ミトコンドリアの標的治療および分析に関連する困難のためによく理解されていない。
解離ニューロンのin vitroでの培養技術における最近の進歩により、マイクロ流体デバイスを介して軸索と細胞体の流体分離が可能になりました5。図1Aに示すように、これらのデバイスは4つのアクセスウェル(a/hとc/i)を備え、2つのチャネルが各ペア(dとf)を接続します。大きなチャンネルは、長さ450μmの一連のマイクロチャンネル(e)によって互いに接続されています。2つのチャンバー間の充填レベルの意図的な違いにより、流体圧力勾配が発生し(図1B)、流体レベルが低いチャネルから反対側への小分子の拡散を防ぎます(図1C、トリパンブルー染料で示されています)。
私たちは最近、マイクロ流体デバイスを使用して、損傷したミトコンドリアの選択的除去である軸索マイトファジーの局所翻訳要件を研究しました6。本プロトコールでは、ミトコンドリア複合体III阻害剤Antimycin A 6,7を用いた軸索の選択的処置を通じて局所ミトコンドリア損傷を誘導するための異なるステップが提示される。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well Glass bottom plate</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06.1.5H-N</td>
			<td>Silicone device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS M5000 widefield microscope</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td>EVOS M5000</td>
			<td>fully integrated digital widefield microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibernate E</td>
			<td>BrainBits</td>
			<td>HE500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted spinning disk confocal</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TI2-E + CSU-W1</td>
			<td>With incubator chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic devices</td>
			<td>XONA microfluidics</td>
			<td>RD450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRE</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>87917</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidics-assisted selective depolarization of axonal mitochondria

ミトコンドリアは、ニューロンにおけるATP(アデノシン三リン酸)の主要な供給者です。ミトコンドリア機能障害は、多くの神経変性疾患において一般的な表現型である。いくつかの軸索の精巧な構造と極端な長さを考えると、軸索のミトコンドリアが細胞体のミトコンドリアと比較して異なる環境を経験する可能性があることは驚くべきことではありません。興味深いことに、軸索ミトコンドリアの機能不全はしばしば細胞体への影響に先行する。in vitroで軸索ミトコンドリア機能障害をモデル化するために、マイクロ流体デバイスは、体細胞ミトコンドリアに影響を与えることなく軸索ミトコンドリアの治療を可能にする。これらのチャンバー内の流体圧力勾配は、勾配に対する分子の拡散を防ぎ、軸索内の局所的な薬理学的課題に応じたミトコンドリア特性の分析を可能にします。現在のプロトコルでは、マイクロ流体デバイスにおける解離した海馬ニューロンの播種、膜電位感受性色素による染色、ミトコンドリア毒素による処理、およびその後の顕微鏡分析について説明しています。軸索生物学を研究するこの汎用性の高い方法は、多くの薬理学的摂動および画像読み出しに適用でき、いくつかのニューロンサブタイプに適しています。

初代海馬ニューロンをマイクロ流体デバイスで7〜8日間増殖させた後、ミトコンドリアを両方のチャネルで膜感受性色素(TMRE)で25分間染色しました。図2Aに示すように、これは微小溝の両側のミトコンドリアの均質な染色をもたらしたが、それでも微小溝の中央への染色を平衡化するには不十分であった。抗マイシンAを軸索側に添加すると、ソームミトコンドリアはTMRE?...

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Microfluidics-Assisted Selective Depolarization of Axonal Mitochondria

本プロトコルは、マイクロ流体チャンバーにおけるニューロンミトコンドリアの播種および染色を記載する。これらのチャンバー内の流体圧力勾配により、軸索のミトコンドリアを選択的に処理して、細胞体コンパートメントに影響を与えることなく、薬理学的課題に応じてその特性を分析することができます。

マイクロフルイディクス支援による軸索ミトコンドリアの選択的脱分極

Mitochondria are the primary suppliers of ATP (adenosine triphosphate) in neurons. Mitochondrial dysfunction is a common phenotype in many ...

ミトコンドリアは神経の健康に不可欠です。多くの神経変性疾患では、軸索ミトコンドリアが最初に罹患しますが、軸索ミトコンドリアがそれほど特別な理由は明らかではありません。このプロトコルで使用されるチャンバー内の流体圧力勾配は、ミトコンドリア軸索の選択的治療を可能にする。これにより、細胞体のプロセスが乱されることなく、軸索生物学に集中することができます。ここでは、膜電位感受性色素によるミトコンドリアの脱分極を示しますが、この方法は多くの異なる神経細胞タイプと蛍光読み出しに適用できます。まず、コード化された6つのウェルプレートを滅菌フードに入れ、滅菌二重蒸留水で2回洗浄します。プレートを傾斜した状態で3〜5分間乾燥させます。真空吸引またはピペッティングによって余分な水分を取り除きます。次に、マイクロ流体チャンバーを80%エタノールに浸します。再度、マイクロ流体チャンバーを傾斜した状態で3〜5分間乾燥させ、ピペットチップで余分なエタノールを除去します。完全に乾いたら、マイクロ流体チャンバーをウェルとプレートの中央に置きます。マイクロ流体チャンバーの境界と中央のマイクロ溝セクションを軽くたたいて、ガラス板に適切に取り付けます。まず、1.5ミリリットルの反応管に所望の数の解離した海馬ニューロンを集める。チューブを1000倍Gで室温で4分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを8マイクロリットルのB−27神経基礎培地に再懸濁する。次に、細胞溶液をマイクロ流体チャンバーのチャネル入口に分注します。プレートの裏側をタップして、チャネルを通る流れを支援します。ピペットを使用して、チャネルの出口で残っている細胞懸濁液を吸引します。マイクロ流体チャンバーを細胞とともに摂氏37度、二酸化炭素5%で15〜20分間インキュベートします。次に、上部の軸索ウェルに50マイクロリットルのB-27神経基底媒体を満たし、プレートの背面をタップして流れを補助します。体細胞側の各ウェルを150マイクロリットルのB-27神経基底媒体で満たし、上部に張力バブルを作成します。また、軸索側の両方のウェルをそれぞれ100マイクロリットルのB-27神経基底培地で満たす。7〜8日間のin vitro培養の後、軸索が微小溝を通って成長し、軸索コンパートメントに伸びていることを確認します。B-27神経基底培地を除去し、軸索チャネルと体細胞チャネルの両方の上部ウェルに100マイクロリットルの予熱したイメージング培地を加えて、デバイスを洗浄します。培地を下のウェルに流します。下のウェルから培地を取り出し、上のウェルから残った培地を取り除き、新しい培地で繰り返し、洗浄の最後にウェルを空のままにします。次に、100マイクロリットルの5ナノモルTMRE希釈液を体細胞ウェルと軸索上部ウェルの両方に追加します。すべてのウェルに等しい容量になるまで、培地を両方のコンパートメントに流します。TMRE含有培地を充填します。体細胞コンパートメントの関心領域を選択し、それを微小溝を通って軸索コンパートメントにたどります。体細胞コンパートメントと軸索コンパートメントで画像化された微小溝が互いに一致していることを確認してください。ファイル名を変更後、励起波長561ナノメートル、発光波長625ナノメートルの赤色蛍光画像を取得します。体細胞側に張力気泡が存在することを確認することにより、体細胞室と軸索室の間の体積差を確保します。次に、チャネル内の培地を除き、軸索側の両方のウェルから画像化媒体を除去する。ミトコンドリアの脱分極を誘発するには、イメージング培地で希釈した160マイクロリットルの20マイクロモル抗マイシンAを上部軸索ウェルに追加します。両方の軸索ウェルに等しい体積になるまでチャネルを流します。マイクログルーブを特定することにより、ベースライン取得時と同じ位置がイメージングされるように、イメージングを繰り返します。このプロトコルを使用して、初代海馬ニューロンをマイクロ流体デバイスで成長させ、続いて膜感受性色素TMREでミトコンドリア染色を行いました。ミトコンドリアの均質染色は微小溝の両側で観察されたが、中央では観察されなかった。抗マイシンAを軸索側に添加すると、ソームミトコンドリアはTMREシグナルを保持しましたが、軸索ミトコンドリアから蛍光が失われました。 デバイスを組み立てる前に、ウェルまたはデバイスに水分が残っていないことを確認してください。そうしないと、チャンバーは密閉されません。この方法を用いて、軸索のミトコンドリア機能の喪失と局所機能の影響、および逆行性シグナル伝達と全体的な細胞生存への影響を研究することができます。ミトコンドリアの生合成は、長い間、細胞体内でのみ起こると考えられていました。この方法により、軸索ミトコンドリアの損傷にはPINK1タンパク質のショートの局所翻訳が必要であることを明らかにしました。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mechanical Manipulation of Neurons to Control Axonal Development

軸索の開発を制御する神経細胞の機械的な操作

Cell manipulations and extension of neuronal axons can be accomplished with calibrated glass micro-fibers capable of measuring and applying forces in the ...

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

軸索損傷後の脊髄後根神経節の組織からのクロマチン免疫沈降

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

ニワトリ胚における軸索軌道とシナプスターゲットを追跡する後脳のエレクトロ

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

鳥類胚性内耳神経における聴覚繊維の選択的なトレース

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

皮質介在ニューロンのサブタイプ選択的エレクトロポレーション

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

一次ニューロンにおける量子ドットで標識されたBDNFの軸索輸送のリアルタイムイメージング

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

Characterizing the Composition of Molecular Motors on Moving Axonal Cargo Using "Cargo Mapping" Analysis

「カーゴマッピング」解析を用いた軸索貨物を移動するに分子モーターの構成を特徴づける

Understanding the mechanisms by which molecular motors coordinate their activities to transport vesicular cargoes within neurons requires the quantitative ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

三次元画像と人間の表皮内神経線維内のミトコンドリアの解析

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

シリアルブロック・フェイス走査型電子顕微鏡を用いて脳ミトコンドリアの解析

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

胎児運動ニューロンの軸索突起パターンの視覚化<em&gt;ショウジョウバエ</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...