Name: microfluidics-assisted selective depolarization of axonal mitochondria
Uploaded: 2022-08-04T14:15:00
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이 연구는 독일 연구 재단 (HA 7728 / 2-1 및 EXC2145 프로젝트 ID 390857198)과 막스 플랑크 학회의 지원을 받았습니다.

모든 동물 실험은 어퍼 바이에른 정부의 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다. 1차 뉴런은앞서 기술된 바와 같은 표준 방법에 따라 남녀 모두의 E16.5 C57BL/6 야생형 마우스 배아로부터 제조하였다 6.
1. 미세유체 장치의 조립
<ol><li>최종 농도가 20μg/mL인 6웰 유리 바닥 조직 배양 플레이트 1개를 PBS(인산염 완충 식염수)에 20μg/mL의 Poly-D-라이신 ...

<ol>
	<li>Murali Mahadevan, H., Hashemiaghdam, A., Ashrafi, G., Harbauer, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+neuronal+health:+from+energy+metabolism+to+Parkinson's+disease.">Mitochondria in neuronal health: from energy metabolism to Parkinson's disease.</a> Advanced Biology. 5 (9), 2100663 (2021).</li><li>Dauer, W., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease:+mechanisms+and+models.">Parkinson's disease: mechanisms and models.</a> Neuron. 39 (6), 889-909 (2003).</li><li>Moratalla, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+vulnerability+of+primate+caudate-putamen+and+striosome-matrix+dopamine+systems+to+the+neurotoxic+effects+of+1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-+tetrahydropyridine.">Differential vulnerability of primate caudate-putamen and striosome-matrix dopamine systems to the neurotoxic effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- tetrahydropyridine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (9), 3859-3863 (1992).</li><li>Cheng, H. -. C., Ulane, C. M., Burke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+progression+in+Parkinson+disease+and+the+neurobiology+of+axons.">Clinical progression in Parkinson disease and the neurobiology of axons.</a> Annals of Neurology. 67 (6), 715-725 (2010).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury,+regeneration+and+transport.">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).</li><li>Harbauer, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+mitochondria+transport+Pink1+mRNA+via+synaptojanin+2+to+support+local+mitophagy.">Neuronal mitochondria transport Pink1 mRNA via synaptojanin 2 to support local mitophagy.</a> Neuron. 110 (9), 1516-1531 (2022).</li><li>Ashrafi, G., Schlehe, J. S., LaVoie, M. J., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+of+damaged+mitochondria+occurs+locally+in+distal+neuronal+axons+and+requires+PINK1+and+Parkin.">Mitophagy of damaged mitochondria occurs locally in distal neuronal axons and requires PINK1 and Parkin.</a> Journal of Cell Biology. 206 (5), 655-670 (2014).</li><li>Shipman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine&#235;thanesulfonic+acid+(HEPES)+as+a+tissue+culture+buffer.">Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine&#235;thanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 130 (1), 305-310 (1969).</li><li>Harbauer, A. B., Schneider, A., Wohlleber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondria+by+single-organelle+resolution.">Analysis of mitochondria by single-organelle resolution.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 15, 1-16 (2022).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+mRNA+in+uninjured+and+regenerating+cortical+mammalian+axons.">Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (15), 4697-4707 (2009).</li><li>Altman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+TDP-43+condensates+drive+neuromuscular+junction+disruption+through+inhibition+of+local+synthesis+of+nuclear+encoded+mitochondrial+proteins.">Axonal TDP-43 condensates drive neuromuscular junction disruption through inhibition of local synthesis of nuclear encoded mitochondrial proteins.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).</li></ol>

본 프로토콜은 해리된 해마 뉴런을 미세유체 장치에서 시드 및 배양하여 축삭 미토콘드리아를 별도로 처리하는 방법을 기술한다. 막 민감성 염료 TMRE 및 복합 III 억제제 안티마이신 A(이전에 입증된바와 같이7)에 대한 이 접근법의 유용성이 여기에서 입증되지만, 이 방법은 국부적 현미경 기반 판독을 허용하는 다른 미토콘드리아 염료 또는 미토콘드리아 기능의 유전적으로 암호...

미토콘드리아는 뉴런에서 ATP(아데노신 삼인산)의 주요 공급업체입니다. 신경 건강은 미토콘드리아 기능과 밀접한 관련이 있기 때문에 이러한 세포 기관의 기능 장애 조절이 파킨슨 병1을 포함한 다양한 신경 퇴행성 질환의 발병과 관련이 있다는 것은 놀라운 일이 아닙니다. 또한, 미토콘드리아 중독은 동물2에서 파킨슨 증상을 모델링하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 동물 모델과 인간 질병 모두에서 뉴런의 소멸은 원위 부분 3,4에서 시작하여 축삭 미토콘드리아가 모욕에 더 취약 할 수 있음을 암시합니다. 그러나, 축삭에서 미토콘드리아의 생물학은 세포체 과정의 동시 교란없이 축삭 미토콘드리아의 표적 치료 및 분석과 관련된 어려움으로 인해 잘 이해되지 않는다.
 시험관 내에서 해리된 뉴런의 배양 기술의 최근 발전은 이제 미세유체 장치5를 통해 축삭과 세포체의 유체 분리를 가능하게 한다. 그림 1A에 표시된 것처럼 이 장치에는 4개의 액세스 웰(a/h 및 c/i)이 있으며 각 쌍(d 및 f)을 연결하는 2개의 채널이 있습니다. 대형 채널은 일련의 450μm 길이의 마이크로 채널(e)에 의해 서로 연결됩니다. 두 챔버 사이의 충전 레벨의 의도적 인 차이는 유체 압력 구배 (그림 1B)를 생성하여 유체 레벨이 낮은 채널에서 다른쪽으로 작은 분자가 확산되는 것을 방지합니다 (그림 1C, Trypan blue 염료로 표시됨).
우리는 최근에 손상된 미토콘드리아6의 선택적 제거인 축삭 미토파지의 국소 번역 요구 사항을 연구하기 위해 미세 유체 장치를 사용했습니다. 본 프로토콜에서, 미토콘드리아 콤플렉스 III 억제제 안티마이신 A 6,7을 사용하는 축삭의 선택적 처리를 통해 국소 미토콘드리아 손상을 유도하는 상이한 단계가 제시된다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well Glass bottom plate</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06.1.5H-N</td>
			<td>Silicone device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS M5000 widefield microscope</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td>EVOS M5000</td>
			<td>fully integrated digital widefield microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibernate E</td>
			<td>BrainBits</td>
			<td>HE500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted spinning disk confocal</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TI2-E + CSU-W1</td>
			<td>With incubator chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic devices</td>
			<td>XONA microfluidics</td>
			<td>RD450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRE</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>87917</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidics-assisted selective depolarization of axonal mitochondria

미토콘드리아는 뉴런에서 ATP(아데노신 삼인산)의 주요 공급원입니다. 미토콘드리아 기능 장애는 많은 신경 퇴행성 질환에서 일반적인 표현형입니다. 일부 축삭의 정교한 구조와 극단적인 길이를 감안할 때 축삭의 미토콘드리아가 세포체와 비교하여 다른 환경을 경험할 수 있다는 것은 놀라운 일이 아닙니다. 흥미롭게도, 축삭 미토콘드리아의 기능 장애는 종종 세포체에 미치는 영향에 선행합니다. 시험관 내에서 축삭 미토콘드리아 기능 장애를 모델링하기 위해, 미세 유체 장치는 체멀 미토콘드리아에 영향을주지 않고 축삭 미토콘드리아의 치료를 가능하게한다. 이 챔버의 유체 압력 구배는 구배에 대한 분자의 확산을 방지하여 축삭 내의 국소 약리학적 문제에 대한 반응으로 미토콘드리아 특성을 분석할 수 있습니다. 현재 프로토콜은 미세 유체 장치에서 해리 된 해마 뉴런의 파종, 막 전위에 민감한 염료로 염색, 미토콘드리아 독소로 처리 및 후속 현미경 분석을 설명합니다. 축삭 생물학을 연구하는이 다목적 방법은 많은 약리학 적 섭동 및 영상 판독에 적용될 수 있으며 여러 신경 아형에 적합합니다.

1차 해마 뉴런은 미토콘드리아가 두 채널 모두에서 25분 동안 막 민감성 염료(TMRE)로 염색되기 전에 7-8일 동안 미세유체 장치에서 성장되었습니다. 도 2A에 도시된 바와 같이, 이것은 마이크로홈의 양쪽에서 미토콘드리아의 균질한 염색을 산출했지만, 마이크로홈의 중간으로의 염색을 평형화하기에는 불충분하였다. 축삭 측에 안티마이신 A를 첨가했을 때, 소말 미토콘드리아?...

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Microfluidics-Assisted Selective Depolarization of Axonal Mitochondria

본 프로토콜은 미세유체 챔버에서 뉴런 미토콘드리아의 파종 및 염색을 기술한다. 이 챔버의 유체 압력 구배는 축삭에서 미토콘드리아를 선택적으로 처리하여 세포체 구획에 영향을 미치지 않고 약리학적 문제에 대응하여 특성을 분석할 수 있도록 합니다.

축삭 미토콘드리아의 미세 유체 보조 선택적 탈분극

Mitochondria are the primary suppliers of ATP (adenosine triphosphate) in neurons. Mitochondrial dysfunction is a common phenotype in many ...

미토콘드리아는 신경 건강에 필수적입니다. 많은 신경 퇴행성 질환에서 축삭 미토콘드리아가 가장 먼저 고통을 겪지 만 축삭 미토콘드리아를 특별하게 만드는 것은 분명하지 않습니다. 이 프로토콜에 사용 된 챔버의 유체 압력 구배는 미토콘드리아 축삭의 선택적 처리를 허용합니다.이것은 세포체 과정을 방해받지 않고 축삭 생물학에 집중할 수있게합니다. 여기서는 막 전위에 민감한 염료를 사용한 미토콘드리아의 탈분극을 보여 주지만이 방법은 다양한 신경 세포 유형 및 형광 판독에 적용 할 수 있습니다. 시작하려면 코딩 된 6 웰 플레이트를 멸균 후드에 넣고 멸균 이중 증류수로 두 번 세척하십시오.플레이트를 기울인 위치에서 3-5분 동안 건조시키십시오. 진공 흡입 또는 피펫팅으로 과도한 물을 제거합니다. 그런 다음 미세 유체 챔버를 80 % 에탄올에 담그십시오.다시, 미세유체 챔버를 기울어진 위치에서 3 내지 5분 동안 건조시키고, 피펫 팁으로 과량의 에탄올을 제거한다. 완전히 건조되면 미세 유체 챔버를 웰과 플레이트의 중앙에 놓습니다. 유리판에 적절하게 부착하기 위해 경계와 중간의 미세 홈 섹션에서 미세 유체 챔버를 부드럽게 두드립니다.먼저, 1.5 밀리리터 반응 튜브에서 원하는 수의 해리 된 해마 뉴런을 수집합니다. 튜브를 실온에서 4 분 동안 1000 배 G로 원심 분리합니다. 상청액을 버리고 펠릿을 8 마이크로 리터의 B-27 신경 기저 배지에 재현 탁하십시오.이어서, 세포 용액을 미세유체 챔버의 채널 입구로 분배한다. 플레이트 뒷면을 탭하여 채널을 통한 흐름을 돕습니다. 피펫을 사용하여 채널 출구에 남아 있는 세포 현탁액을 흡인합니다.세포와 함께 미세유체 챔버를 섭씨 37도 및 5%이산화탄소에서 15 내지 20분 동안 배양한다. 다음으로, 상단 축삭 웰을 50 마이크로 리터의 B-27 신경 기저 매체로 채우고 플레이트 뒷면을 두드려 흐름을 돕습니다. 소마 쪽의 각 웰을 150 마이크로 리터의 B-27 신경 기저 배지로 채우고 위에 장력 거품을 만듭니다.또한 축삭 쪽의 두 웰을 각각 100 마이크로 리터의 B-27 신경 기저 매체로 채 웁니다. 7-8일의 시험관 내 배양 후, 축삭이 마이크로홈을 통해 성장하고 축삭 구획으로 확장되었는지 확인하십시오. B-27 신경 기저 배지를 제거하고 축삭 및 소마 채널의 상단 웰에 100 마이크로 리터의 예열 된 이미징 배지를 추가하여 장치를 세척하십시오.매체가 하부 우물로 흐르도록하십시오. 하부 웰에서 배지를 제거하고 상단 웰에서 남은 배지를 제거하고 세척이 끝날 때 웰을 비워두고 새 배지로 반복합니다. 그런 다음 체세포 및 축삭 상단 웰 모두에 100 마이크로 리터의 5 나노 몰 TMRE 희석액을 첨가하십시오.모든 우물에 동일한 부피가 될 때까지 매체가 두 구획을 통해 흐르도록하십시오. TMRE 함유 매체로 채웁니다. 체세포 구획에서 관심 영역을 선택하고 미세 홈을 통해 축삭 구획으로 따라갑니다.체세포 구획과 축삭 구획에서 이미징된 미세 홈이 서로 일치하는지 확인합니다. 파일 이름을 변경한 후 561나노미터 여기 및 625나노미터 방출 파장을 사용하여 적색 형광 이미지를 획득합니다. 체세포면에 장력 기포가 있는지 확인하여 체세포와 축삭 챔버 사이의 부피 차이를 확인하십시오.그런 다음 채널 내부의 매체를 제외한 축삭 측의 양쪽 웰에서 이미징 매체를 제거합니다. 미토콘드리아 탈분극을 유도하려면 이미징 매체에 희석 된 160 마이크로 리터의 20 마이크로 몰 항 마이신 A를 상단 축삭 웰에 첨가하십시오. 두 축삭 우물에 동일한 부피가 될 때까지 채널을 통해 흐르게하십시오.이미징을 반복하여 마이크로홈을 식별하여 베이스라인 획득 동안과 동일한 위치가 이미징되도록 합니다. 이 프로토콜을 사용하여 일차 해마 뉴런을 미세 유체 장치에서 성장시킨 다음 막 민감성 염료 TMRE로 미토콘드리아 염색을 수행했습니다. 미토콘드리아의 균질 염색은 마이크로 홈의 양쪽에서 관찰되었지만 중간에서는 관찰되지 않았습니다.축삭 측에 안티마이신 A를 첨가하면 소멀 미토콘드리아는 TMRE 신호를 유지하는 반면 축삭 미토콘드리아에서 형광이 손실되었습니다. 장치를 조립하기 전에 우물이나 장치에 수분이 남아 있지 않은지 확인하십시오. 그렇지 않으면 챔버가 밀봉되지 않습니다. 이 방법을 사용하여 축삭 및 국소 기능에서 미토콘드리아 기능의 상실 효과뿐만 아니라 역행 신호 전달 및 글로벌 세포 생존에 미치는 영향을 연구 할 수 있습니다.미토콘드리아 생물 발생은 오랫동안 세포체에서만 발생하는 것으로 생각되어 왔습니다. 이 방법을 통해 우리는 축삭 미토콘드리아 손상이 단백질 PINK1의 짧은 국소 번역을 필요로한다는 것을 밝힐 수있었습니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mechanical Manipulation of Neurons to Control Axonal Development

Axonal 개발 제어하기 위해 뉴런의 기계 조작

Cell manipulations and extension of neuronal axons can be accomplished with calibrated glass micro-fibers capable of measuring and applying forces in the ...

연구

신경과학

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Axonal 상해 다음 도설 루트 신경 조직에서 염색질의 Immunoprecipitation

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

병아리 배아에서 축삭 궤적과 시냅스 대상을 추적하는 후뇌의 일렉트로

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

조류 배아 Vestibulocochlear 신경 청각 섬유의 선택적 추적

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

두피의 interneurons의 하위 유형 선택적 일렉트로

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

양자의 축삭 교통 수단의 실시간 이미징 차 뉴런에서 BDNF를 도트 표지

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

Characterizing the Composition of Molecular Motors on Moving Axonal Cargo Using "Cargo Mapping" Analysis

사용 축삭화물을 이동하는 분자 모터의 구성을 특성화 &quot;화물 매핑&quot;분석

Understanding the mechanisms by which molecular motors coordinate their activities to transport vesicular cargoes within neurons requires the quantitative ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

3 차원 영상 및 인간 Intraepidermal 신경 섬유 내 미토 콘 드리 아의 분석

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

직렬 블록 얼​​굴 스캐닝 전자 현미경을 사용하여 뇌 미토콘드리아 분석

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

배아 운동 뉴런의 Axonal 투영 패턴의 시각화<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...