Name: microfluidics-assisted selective depolarization of axonal mitochondria
Uploaded: 2022-08-04T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidics-Assisted Selective Depolarization of Axonal Mitochondria at JoVE.com

Denne studien ble støttet av German Research Foundation (HA 7728/2-1 og EXC2145 Project ID 390857198) og Max Planck Society.

Alle dyreforsøk ble utført i henhold til relevante retningslinjer og forskrifter fra regjeringen i Øvre Bayern. De primære nevronene ble fremstilt fra E16.5 C57BL/6 museembryoer av begge kjønn etter standardmetoder som tidligere beskrevet6.
1. Montering av mikrofluidisk enhet
<ol><li>Belegg en seks-brønns glassbunnsvevskulturplate med en endelig konsentrasjon på 20 μg / ml Poly-D-lysin og 3,4 μg / ml Laminin i PBS (fosfatbufret saltvann) (se ...

<ol>
	<li>Murali Mahadevan, H., Hashemiaghdam, A., Ashrafi, G., Harbauer, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+neuronal+health:+from+energy+metabolism+to+Parkinson's+disease.">Mitochondria in neuronal health: from energy metabolism to Parkinson's disease.</a> Advanced Biology. 5 (9), 2100663 (2021).</li><li>Dauer, W., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease:+mechanisms+and+models.">Parkinson's disease: mechanisms and models.</a> Neuron. 39 (6), 889-909 (2003).</li><li>Moratalla, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+vulnerability+of+primate+caudate-putamen+and+striosome-matrix+dopamine+systems+to+the+neurotoxic+effects+of+1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-+tetrahydropyridine.">Differential vulnerability of primate caudate-putamen and striosome-matrix dopamine systems to the neurotoxic effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- tetrahydropyridine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (9), 3859-3863 (1992).</li><li>Cheng, H. -. C., Ulane, C. M., Burke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+progression+in+Parkinson+disease+and+the+neurobiology+of+axons.">Clinical progression in Parkinson disease and the neurobiology of axons.</a> Annals of Neurology. 67 (6), 715-725 (2010).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury,+regeneration+and+transport.">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).</li><li>Harbauer, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+mitochondria+transport+Pink1+mRNA+via+synaptojanin+2+to+support+local+mitophagy.">Neuronal mitochondria transport Pink1 mRNA via synaptojanin 2 to support local mitophagy.</a> Neuron. 110 (9), 1516-1531 (2022).</li><li>Ashrafi, G., Schlehe, J. S., LaVoie, M. J., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+of+damaged+mitochondria+occurs+locally+in+distal+neuronal+axons+and+requires+PINK1+and+Parkin.">Mitophagy of damaged mitochondria occurs locally in distal neuronal axons and requires PINK1 and Parkin.</a> Journal of Cell Biology. 206 (5), 655-670 (2014).</li><li>Shipman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine&#235;thanesulfonic+acid+(HEPES)+as+a+tissue+culture+buffer.">Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine&#235;thanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 130 (1), 305-310 (1969).</li><li>Harbauer, A. B., Schneider, A., Wohlleber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondria+by+single-organelle+resolution.">Analysis of mitochondria by single-organelle resolution.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 15, 1-16 (2022).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+mRNA+in+uninjured+and+regenerating+cortical+mammalian+axons.">Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (15), 4697-4707 (2009).</li><li>Altman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+TDP-43+condensates+drive+neuromuscular+junction+disruption+through+inhibition+of+local+synthesis+of+nuclear+encoded+mitochondrial+proteins.">Axonal TDP-43 condensates drive neuromuscular junction disruption through inhibition of local synthesis of nuclear encoded mitochondrial proteins.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).</li></ol>

Den nåværende protokollen beskriver en metode for å frø og dyrke dissosierte hippocampale nevroner i en mikrofluidisk enhet for å behandle aksonale mitokondrier separat. Nytten av denne tilnærmingen med det membranfølsomme fargestoffet TMRE og den komplekse III-hemmeren Antimycin A (som tidligere demonstrert7) er demonstrert her, men denne metoden kan enkelt tilpasses andre mitokondrielle fargestoffer eller genetisk kodede sensorer av mitokondrielle funksjoner som tillater lokale, mikroskop...

Mitokondrier er de viktigste leverandørene av ATP (adenosintrifosfat) i nevroner. Siden nevronhelse er nært knyttet til mitokondriell funksjon, er det ikke overraskende at dysfunksjonell regulering av disse organellene har vært assosiert med utbruddet av ulike nevrodegenerative sykdommer, inkludert Parkinsonssykdom. Videre har mitokondriell forgiftning med hell blitt brukt til å modellere Parkinsonske symptomer hos dyr2. I både dyremodeller og menneskelig sykdom starter bortfallet av nevroner ved de distale delene3,4, noe som antyder at aksonale mitokondrier kan være mer utsatt for fornærmelser. Imidlertid er biologien til mitokondrier i axoner ikke godt forstått på grunn av vanskelighetene forbundet med målrettet behandling og analyse av aksonale mitokondrier uten samtidig forstyrrelse av cellekroppsprosesser.
Nylige fremskritt innen dyrkingsteknikker av dissosierte nevroner in vitro tillater nå fluidisk separasjon av aksoner og cellelegemer gjennom mikrofluidiske enheter5. Som vist i figur 1A, har disse enhetene fire tilgangsbrønner (a/h og c/i), med to kanaler som forbinder hvert par (d og f). De store kanalene er forbundet med hverandre med en serie på 450 μm lange mikrokanaler (e). Tilsiktede forskjeller i fyllingsnivåene mellom de to kamrene skaper en væsketrykkgradient (figur 1B) som forhindrer diffusjon av små molekyler fra kanalen med lavere væskenivå til den andre siden (figur 1C, illustrert med Trypan blått fargestoff).
Vi har nylig brukt mikrofluidiske enheter for å studere lokale oversettelseskrav i aksonal mitophagy, selektiv fjerning av skadede mitokondrier6. I denne protokollen presenteres forskjellige trinn for å indusere lokal mitokondriell skade gjennom selektiv behandling av aksoner ved bruk av mitokondriekomplekset III-hemmeren Antimycin A 6,7.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well Glass bottom plate</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06.1.5H-N</td>
			<td>Silicone device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS M5000 widefield microscope</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td>EVOS M5000</td>
			<td>fully integrated digital widefield microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibernate E</td>
			<td>BrainBits</td>
			<td>HE500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted spinning disk confocal</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TI2-E + CSU-W1</td>
			<td>With incubator chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic devices</td>
			<td>XONA microfluidics</td>
			<td>RD450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRE</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>87917</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidics-assisted selective depolarization of axonal mitochondria

Mitokondrier er de primære leverandørene av ATP (adenosintrifosfat) i nevroner. Mitokondriell dysfunksjon er en vanlig fenotype i mange nevrodegenerative sykdommer. Gitt noen aksoners forseggjorte arkitektur og ekstreme lengde, er det ikke overraskende at mitokondrier i aksoner kan oppleve forskjellige miljøer sammenlignet med deres cellekroppsmodeller. Interessant, dysfunksjon av aksonale mitokondrier går ofte foran effekter på cellekroppen. For å modellere aksonal mitokondriell dysfunksjon in vitro, tillater mikrofluidiske enheter behandling av aksonale mitokondrier uten å påvirke de somale mitokondriene. Den fluidiske trykkgradienten i disse kamrene forhindrer diffusjon av molekyler mot gradienten, og muliggjør dermed analyse av mitokondrielle egenskaper som svar på lokale farmakologiske utfordringer i aksoner. Den nåværende protokollen beskriver såing av dissosierte hippocampale nevroner i mikrofluidiske enheter, farging med et membranpotensial følsomt fargestoff, behandling med mitokondrielt toksin og den påfølgende mikroskopiske analysen. Denne allsidige metoden for å studere aksonal biologi kan brukes på mange farmakologiske forstyrrelser og bildeavlesninger, og er egnet for flere neuronale subtyper.

Primære hippocampale nevroner ble dyrket i mikrofluidiske enheter i 7-8 dager før mitokondrier ble farget med det membranfølsomme fargestoffet (TMRE) i 25 minutter i begge kanalene. Som vist i figur 2A ga dette homogen farging av mitokondrier på begge sider av mikrogroovene, men det var likevel ikke tilstrekkelig til å likestille fargingen i midten av mikrogroovene. Ved tillegg av antimycin A til aksonal side beholdt somale mitokondrier TMRE-signalet (figur 2B</stro...

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidics-Assisted Selective Depolarization of Axonal Mitochondria at JoVE.com

Microfluidics-Assisted Selective Depolarization of Axonal Mitochondria

Denne protokollen beskriver såing og farging av nevronale mitokondrier i mikrofluidiske kamre. Den fluidiske trykkgradienten i disse kamrene muliggjør selektiv behandling av mitokondrier i aksoner for å analysere deres egenskaper som svar på farmakologiske utfordringer uten å påvirke cellekroppen.

Mikrofluidikk-assistert selektiv depolarisering av aksonale mitokondrier

Mitochondria are the primary suppliers of ATP (adenosine triphosphate) in neurons. Mitochondrial dysfunction is a common phenotype in many ...

Mitokondrier er avgjørende for nevronal helse. I mange nevrodegenerative sykdommer er aksonale mitokondrier de første som lider, men det er ikke klart hva som gjør aksonale mitokondrier så spesielle. Den fluidiske trykkgradienten i kamrene som brukes i denne protokollen tillater selektiv behandling av mitokondrion aksoner.Dette etterlater cellekroppens prosesser uforstyrret, og lar oss fokusere på aksonal biologi. Vi viser her depolariseringen av mitokondrier med et membranpotensial følsomt fargestoff, men denne metoden kan brukes på mange forskjellige nevroncelletyper og fluorescerende avlesninger. For å begynne, plasser de kodede seks brønnplatene i en steril hette, og vask dem to ganger med sterilt dobbelt destillert vann.La platene tørke i vippet stilling i tre til fem minutter. Fjern overflødig vann ved vakuumsuging eller pipettering. Deretter suge mikrofluidisk kammer i 80% etanol.Igjen, tørk det mikrofluidiske kammeret i tre til fem minutter i vippet stilling, og fjern overflødig etanol med en pipettespiss. Når det er helt tørt, plasser det mikrofluidiske kammeret i midten av brønnen og platen. Bank forsiktig på mikrofluidkammeret ved grensene og mikrogrooveseksjonen i midten for riktig festing til glassplaten.Først samler du ønsket antall dissosierte hippocampale nevroner i et 1, 5 milliliter reaksjonsrør. Sentrifuger røret ved 1000 ganger G i fire minutter ved romtemperatur. Kast supernatanten, og resuspend pelleten i åtte mikroliter B-27 neuro basale medier.Dispenser deretter celleoppløsningen i kanalinngangen til mikrofluidisk kammer. Trykk på baksiden av platen for å hjelpe strømmen gjennom kanalen. Bruk en pipette, aspirer eventuell gjenværende cellesuspensjon ved utgangen av kanalen.Inkuber mikrofluidkammeret med celler i 15 til 20 minutter ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid. Deretter fyller du den øverste aksonale brønnen med 50 mikroliter B-27 neurobasale medier, og banker på baksiden av platen for å hjelpe strømmen. Fyll hver brønn på soma-siden med 150 mikroliter B-27 neurobasale medier, og skap en spenningsboble på toppen.Fyll også begge brønnene på aksonalsiden med 100 mikroliter B-27 neurobasale medier hver. Etter syv til åtte dager med in vitro-kultur, sørg for at aksonene har vokst gjennom mikrogroovene, og utvidet seg inn i aksonalrommet. Vask enheten ved å fjerne B-27 neurobasal medium, og tilsett 100 mikroliter forvarmet bildebehandlingsmedium til toppbrønnene i både aksonale og somakanaler.La mediet strømme gjennom til de nedre brønnene. Fjern mediet fra de nedre brønnene, og eventuelt gjenværende medium fra de øverste brønnene, og gjenta med friskt medium, og la brønnene være tomme på slutten av vasken. Tilsett deretter 100 mikroliter med fem nanomolar TMRE-fortynning til både de somatiske og aksonale toppbrønnene.La mediet strømme gjennom begge rom, til det er like stort volum i alle brønner. Fyll opp med TMRE-inneholdende medium. Velg et område av interesse i det somatiske rommet, og følg det gjennom mikrogroovene inn i det aksonale rommet.Sørg for at mikrosporene som er avbildet i de somatiske og aksonale rommene, er tilpasset hverandre. Etter å ha endret filnavnet, skaff deg røde fluorescensbilder ved hjelp av 561 nanometer eksitasjon og 625 nanometer utslippsbølgelengder. Sørg for en volumforskjell mellom soma og aksonale kamre ved å kontrollere tilstedeværelsen av en spenningsboble på den somatiske siden.Fjern deretter bildemediet fra begge brønnene på aksonalsiden, bortsett fra mediet inne i kanalen. For å indusere mitokondriell depolarisering, tilsett 160 mikroliter 20 mikromolar antimycin A fortynnet i bildemediet til den øverste aksonale brønnen. La det strømme gjennom kanalen til det er like stort volum i begge aksonale brønner.Gjenta avbildningen, og sørg for at de samme posisjonene er avbildet som under grunnlinjeinnsamlingen, ved å identifisere mikrogroovene. Ved hjelp av denne protokollen ble primære hippocampale nevroner dyrket i mikrofluidiske enheter, etterfulgt av mitokondriell farging med et membranfølsomt fargestoff, TMRE. Homogen farging av mitokondrier ble observert på begge sider av mikrogroovene, men ikke i midten.Ved tilsetning av antimycin A til aksonal side beholdt somale mitokondrier TMRE-signalet, mens fluorescensen gikk tapt fra aksonale mitokondrier Forsikre deg om at det ikke er fuktighet igjen i brønnen eller på enheten før du monterer enheten. Ellers vil kamrene ikke bli forseglet. Ved hjelp av denne metoden kan vi studere effekten av tap av mitokondriell funksjon i akson- og lokale funksjoner, samt dens innflytelse på retrograd signalering og global celleoverlevelse.Mitokondriell biogenese ble lenge antatt å skje utelukkende i cellekroppen. Denne metoden tillot oss å avsløre at aksonale mitokondrier skade krevde lokal oversettelse av kort protein PINK1.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mechanical Manipulation of Neurons to Control Axonal Development

Cell manipulations and extension of neuronal axons can be accomplished with calibrated glass micro-fibers capable of measuring and applying forces in the ...

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Electroporation av hindbrain å spore Aksonal Trajectories og Synaptic Targets i Chick Embryo

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

Selektiv Tracing av auditiv Fibers i Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

Subtype-selektiv Electroporation av Cortical interneuroner

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

Real-time Imaging av aksonal Transport av Quantum Dot-merket BDNF i Primær Neuroner

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

Characterizing the Composition of Molecular Motors on Moving Axonal Cargo Using "Cargo Mapping" Analysis

Karakteriserer Sammensetning for molekylær Motors på Moving aksonale Cargo Ved hjelp av &quot;Cargo Mapping&quot; Analyse

Understanding the mechanisms by which molecular motors coordinate their activities to transport vesicular cargoes within neurons requires the quantitative ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

Tredimensjonale Imaging og analyse av mitokondrier i menneskelig Intraepidermal Nerve Fibre

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Analyse av Brain Mitokondrier Bruke Serial Block-Face Scanning elektronmikroskopi

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualisering av Axonal Projeksjonsmønsteret av Embryoniske Motor Neuroner i<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...