Name: microfluidics-assisted selective depolarization of axonal mitochondria
Uploaded: 2022-08-04T14:15:00
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Este estudo foi apoiado pela Fundação Alemã de Pesquisa (HA 7728/2-1 e EXC2145 Project ID 390857198) e pela Sociedade Max Planck.

Todos os experimentos em animais foram realizados seguindo as diretrizes e regulamentos relevantes do Governo da Alta Baviera. Os neurônios primários foram preparados a partir de embriões de camundongos do tipo selvagem E16.5 C57BL/6 de ambos os sexos, seguindo métodos padrão, conforme descrito anteriormente6.
1. Montagem do dispositivo microfluídico
<ol><li>Revestir uma placa de cultura de tecido com fundo de vidro de seis poços com uma concen...

<ol>
	<li>Murali Mahadevan, H., Hashemiaghdam, A., Ashrafi, G., Harbauer, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+neuronal+health:+from+energy+metabolism+to+Parkinson's+disease.">Mitochondria in neuronal health: from energy metabolism to Parkinson's disease.</a> Advanced Biology. 5 (9), 2100663 (2021).</li><li>Dauer, W., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease:+mechanisms+and+models.">Parkinson's disease: mechanisms and models.</a> Neuron. 39 (6), 889-909 (2003).</li><li>Moratalla, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+vulnerability+of+primate+caudate-putamen+and+striosome-matrix+dopamine+systems+to+the+neurotoxic+effects+of+1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-+tetrahydropyridine.">Differential vulnerability of primate caudate-putamen and striosome-matrix dopamine systems to the neurotoxic effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- tetrahydropyridine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (9), 3859-3863 (1992).</li><li>Cheng, H. -. C., Ulane, C. M., Burke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+progression+in+Parkinson+disease+and+the+neurobiology+of+axons.">Clinical progression in Parkinson disease and the neurobiology of axons.</a> Annals of Neurology. 67 (6), 715-725 (2010).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury,+regeneration+and+transport.">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).</li><li>Harbauer, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+mitochondria+transport+Pink1+mRNA+via+synaptojanin+2+to+support+local+mitophagy.">Neuronal mitochondria transport Pink1 mRNA via synaptojanin 2 to support local mitophagy.</a> Neuron. 110 (9), 1516-1531 (2022).</li><li>Ashrafi, G., Schlehe, J. S., LaVoie, M. J., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+of+damaged+mitochondria+occurs+locally+in+distal+neuronal+axons+and+requires+PINK1+and+Parkin.">Mitophagy of damaged mitochondria occurs locally in distal neuronal axons and requires PINK1 and Parkin.</a> Journal of Cell Biology. 206 (5), 655-670 (2014).</li><li>Shipman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine&#235;thanesulfonic+acid+(HEPES)+as+a+tissue+culture+buffer.">Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine&#235;thanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 130 (1), 305-310 (1969).</li><li>Harbauer, A. B., Schneider, A., Wohlleber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondria+by+single-organelle+resolution.">Analysis of mitochondria by single-organelle resolution.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 15, 1-16 (2022).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+mRNA+in+uninjured+and+regenerating+cortical+mammalian+axons.">Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (15), 4697-4707 (2009).</li><li>Altman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+TDP-43+condensates+drive+neuromuscular+junction+disruption+through+inhibition+of+local+synthesis+of+nuclear+encoded+mitochondrial+proteins.">Axonal TDP-43 condensates drive neuromuscular junction disruption through inhibition of local synthesis of nuclear encoded mitochondrial proteins.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).</li></ol>

O presente protocolo descreve um método para semear e cultivar neurônios hipocampais dissociados em um dispositivo microfluídico para tratar mitocôndrias axonais separadamente. A utilidade dessa abordagem com o corante sensível à membrana TMRE e o inibidor do complexo III Antimicina A (como demonstrado anteriormente7) é demonstrada aqui, mas esse método pode ser facilmente adaptado a outros corantes mitocondriais ou sensores geneticamente codificados de funções mitocondriais que permitem...

As mitocôndrias são os principais fornecedores de ATP (trifosfato de adenosina) nos neurônios. Como a saúde neuronal está intimamente ligada à função mitocondrial, não é de surpreender que a regulação disfuncional dessas organelas tenha sido associada ao aparecimento de várias doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Parkinson1. Além disso, a intoxicação mitocondrial tem sido utilizada com sucesso para modelar sintomas parkinsonianos em animais2. Tanto em modelos animais quanto em doenças humanas, o desaparecimento dos neurônios começa nas partes distais3,4, sugerindo que as mitocôndrias axonais podem ser mais suscetíveis a insultos. No entanto, a biologia das mitocôndrias nos axônios não é bem compreendida devido às dificuldades associadas ao tratamento direcionado e à análise das mitocôndrias axonais sem perturbação simultânea dos processos do corpo celular.
Avanços recentes em técnicas de cultura de neurônios dissociados in vitro agora permitem a separação fluídica de axônios e corpos celulares através de dispositivos microfluídicos5. Conforme mostrado na Figura 1A, esses dispositivos apresentam quatro poços de acesso (a/h e c/i), com dois canais conectando cada par (d e f). Os grandes canais estão conectados uns com os outros por uma série de microcanais de 450 μm de comprimento (e). Diferenças intencionais nos níveis de enchimento entre as duas câmaras criam um gradiente de pressão do fluido (Figura 1B) que impede a difusão de pequenas moléculas do canal com um nível de fluido mais baixo para o outro lado (Figura 1C, ilustrada com corante azul de Trypan).
Recentemente, utilizamos dispositivos microfluídicos para estudar os requisitos de tradução local na mitofagia axonal, a remoção seletiva de mitocôndrias danificadas6. No presente protocolo, diferentes etapas são apresentadas para induzir dano mitocondrial local por meio do tratamento seletivo de axônios utilizando o inibidor do complexo mitocondrial III Antimicina A 6,7.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well Glass bottom plate</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06.1.5H-N</td>
			<td>Silicone device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS M5000 widefield microscope</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td>EVOS M5000</td>
			<td>fully integrated digital widefield microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibernate E</td>
			<td>BrainBits</td>
			<td>HE500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted spinning disk confocal</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TI2-E + CSU-W1</td>
			<td>With incubator chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic devices</td>
			<td>XONA microfluidics</td>
			<td>RD450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRE</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>87917</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidics-assisted selective depolarization of axonal mitochondria

As mitocôndrias são os principais fornecedores de ATP (trifosfato de adenosina) nos neurônios. A disfunção mitocondrial é um fenótipo comum em muitas doenças neurodegenerativas. Dada a arquitetura elaborada e o comprimento extremo de alguns axônios, não é surpreendente que as mitocôndrias nos axônios possam experimentar ambientes diferentes em comparação com suas contrapartes do corpo celular. Curiosamente, a disfunção das mitocôndrias axonais muitas vezes precede os efeitos no corpo celular. Para modelar a disfunção mitocondrial axonal in vitro, os dispositivos microfluídicos permitem o tratamento das mitocôndrias axonais sem afetar as mitocôndrias somais. O gradiente de pressão fluídica nessas câmaras impede a difusão de moléculas contra o gradiente, permitindo assim a análise das propriedades mitocondriais em resposta a desafios farmacológicos locais dentro dos axônios. O protocolo atual descreve a semeadura de neurônios hipocampais dissociados em dispositivos microfluídicos, coloração com um corante sensível ao potencial de membrana, tratamento com uma toxina mitocondrial e a subsequente análise microscópica. Este método versátil para estudar a biologia axonal pode ser aplicado a muitas perturbações farmacológicas e leituras de imagem, e é adequado para vários subtipos neuronais.

Os neurônios primários do hipocampo foram cultivados em dispositivos microfluídicos por 7-8 dias antes que as mitocôndrias fossem coradas com o corante sensível à membrana (TMRE) por 25 minutos em ambos os canais. Como mostrado na Figura 2A, isso produziu coloração homogênea de mitocôndrias em ambos os lados dos microsulcos, mas foi insuficiente para equilibrar a coloração no meio dos microsulcos. Após a adição de Antimicina A ao lado axonal, as mitocôndrias sanais retiveram ...

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Microfluidics-Assisted Selective Depolarization of Axonal Mitochondria

O presente protocolo descreve a semeadura e coloração de mitocôndrias neuronais em câmaras microfluídicas. O gradiente de pressão fluídica nessas câmaras permite o tratamento seletivo de mitocôndrias em axônios para analisar suas propriedades em resposta a desafios farmacológicos sem afetar o compartimento do corpo celular.

Despolarização Seletiva Assistida por Microfluídica das Mitocôndrias Axonais

Mitochondria are the primary suppliers of ATP (adenosine triphosphate) in neurons. Mitochondrial dysfunction is a common phenotype in many ...

As mitocôndrias são essenciais para a saúde neuronal. Em muitas doenças neurodegenerativas, as mitocôndrias axonais são as primeiras a sofrer, mas não está claro o que torna as mitocôndrias axonais tão especiais. O gradiente de pressão fluídica nas câmaras utilizadas neste protocolo permite o tratamento seletivo dos axônios das mitocôndrias.Isso deixa os processos do corpo celular inalterados e nos permite focar na biologia axonal. Mostramos aqui a despolarização das mitocôndrias com um corante sensível ao potencial de membrana, mas esse método pode ser aplicado a muitos tipos diferentes de células neuronais e leituras fluorescentes. Para começar, coloque as seis placas de poço codificadas em um exaustor estéril e lave-as duas vezes com água destilada dupla estéril.Deixe as placas secarem em uma posição inclinada por três a cinco minutos. Remova o excesso de água por sucção a vácuo ou pipetagem. Em seguida, mergulhe a câmara microfluídica em etanol a 80%.Novamente, seque a câmara microfluídica por três a cinco minutos em uma posição inclinada e remova o excesso de etanol com uma ponta de pipeta. Quando completamente seco, coloque a câmara microfluídica no centro do poço e da placa. Bata suavemente na câmara microfluídica em suas bordas e na seção de microsulco no meio para fixação adequada à placa de vidro.Primeiro, colete o número desejado de neurônios do hipocampo dissociados em um tubo de reação de 1,5 mililitro. Centrifugar o tubo a 1000 vezes G durante quatro minutos à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em oito microlitros de meio neurobasal B-27.Em seguida, dispense a solução celular na entrada do canal da câmara microfluídica. Toque na parte de trás da placa para ajudar o fluxo através do canal. Usando uma pipeta, aspirar qualquer suspensão de célula restante na saída do canal.Incubar a câmara microfluídica com células durante 15 a 20 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Em seguida, preencha o poço axonal superior com 50 microlitros de meio neurobasal B-27 e toque na parte de trás da placa para ajudar no fluxo. Preencha cada poço no lado do soma com 150 microlitros de meio neurobasal B-27, criando uma bolha de tensão no topo.Também encha ambos os poços do lado axonal com 100 microlitros de B-27 meios neurobasais cada. Após sete a oito dias de cultura in vitro, certifique-se de que os axônios cresceram através dos microsulcos e se estenderam para o compartimento axonal. Lave o dispositivo removendo o meio neurobasal B-27 e adicionando 100 microlitros de meio de imagem pré-aquecido aos poços superiores dos canais axonal e soma.Deixe o meio fluir através dos poços inferiores. Retire o meio dos poços inferiores, e qualquer meio remanescente dos poços superiores, e repita com meio fresco, deixando os poços vazios no final da lavagem. Em seguida, adicione 100 microlitros de cinco diluições de TMRE nanomolares aos poços somática e axonal.Deixe o meio fluir através de ambos os compartimentos, até que haja um volume igual em todos os poços. Encha com o meio contendo TMRE. Selecione uma região de interesse no compartimento somático e siga-a através dos microsulcos até o compartimento axonal.Certifique-se de que os micro sulcos fotografados nos compartimentos somático e axonal sejam combinados entre si. Depois de alterar o nome do arquivo, adquira imagens de fluorescência vermelha usando excitação de 561 nanômetros e comprimentos de onda de emissão de 625 nanômetros. Garanta uma diferença de volume entre as câmaras soma e axonal, verificando a presença de uma bolha de tensão no lado somático.Em seguida, remova o meio de imagem de ambos os poços do lado axonal, exceto do meio dentro do canal. Para induzir a despolarização mitocondrial, adicione 160 microlitros de 20 antimicina A micromolar diluídos no meio de imagem ao poço axonal superior. Deixe-o fluir através do canal até que haja um volume igual em ambos os poços axonais.Repita a imagem, garantindo que as mesmas posições sejam visualizadas durante a aquisição da linha de base, identificando os microsulcos. Usando este protocolo, os neurônios primários do hipocampo foram cultivados em dispositivos microfluídicos, seguidos por coloração mitocondrial com um corante sensível à membrana, TMRE. A coloração homogênea das mitocôndrias foi observada em ambos os lados dos microsulcos, mas não no meio.Após a adição de antimicina A ao lado axonal, as mitocôndrias somal mantiveram o sinal TMRE, enquanto a fluorescência foi perdida das mitocôndrias axonais Certifique-se de que nenhuma umidade seja deixada no poço ou no dispositivo antes de montar o dispositivo. Caso contrário, as câmaras não serão seladas. Usando este método, podemos estudar os efeitos da perda da função mitocondrial no axônio e funções locais, bem como sua influência na sinalização retrógrada e na sobrevivência celular global.Acreditava-se que a biogênese mitocondrial acontecia exclusivamente no corpo celular. Este método permitiu-nos revelar que o dano das mitocôndrias axonais exigia a tradução local da proteína PINK1.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mechanical Manipulation of Neurons to Control Axonal Development

A manipulação mecânica de Neurônios para controlar o desenvolvimento Axonal

Cell manipulations and extension of neuronal axons can be accomplished with calibrated glass micro-fibers capable of measuring and applying forces in the ...

Neurociência

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Cromatina imunoprecipitação de Tissue Dorsal Root Gânglios seguintes Lesão Axonal

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Eletroporação do rombencéfalo rastrear Trajetórias axonal e Metas Synaptic no embrião de galinha

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

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Rastreamento seletiva de fibras no nervo auditivo embrionário aviária Vestibulococlear

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Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

Subtipo seletivo Eletroporação de Cortical Interneurônios

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

Imagens em tempo real de axonal Transporte de Quantum Dot marcado BDNF na Primária Neurônios

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Characterizing the Composition of Molecular Motors on Moving Axonal Cargo Using "Cargo Mapping" Analysis

Caracterizar a composição de motores moleculares sobre Movimentação axonal Carga Utilizando Análise &quot;Mapeamento Cargo&quot;

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Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

Imagem tridimensional e análise de mitocôndrias dentro as fibras nervosas intraepidérmicas humana

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Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Análise do Cérebro mitocôndrias Usando Serial Block-cara Scanning Electron Microscopy

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Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualização do Padrão de Projeção Axonal de Neurônios de Motor Embrionários em<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...