Name: microfluidics-assisted selective depolarization of axonal mitochondria
Uploaded: 2022-08-04T14:15:00
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Este estudio fue apoyado por la Fundación Alemana de Investigación (HA 7728/2-1 y EXC2145 Project ID 390857198) y la Sociedad Max Planck.

Todos los experimentos con animales se realizaron siguiendo las directrices y reglamentos pertinentes del Gobierno de Alta Baviera. Las neuronas primarias se prepararon a partir de embriones de ratón de tipo salvaje E16.5 C57BL / 6 de ambos sexos siguiendo los métodos estándar descritos anteriormente6.
1. Montaje del dispositivo microfluídico
<ol><li>Cubra una placa de cultivo de tejido con fondo de vidrio de seis pocillos con una concentración f...

<ol>
	<li>Murali Mahadevan, H., Hashemiaghdam, A., Ashrafi, G., Harbauer, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+neuronal+health:+from+energy+metabolism+to+Parkinson's+disease.">Mitochondria in neuronal health: from energy metabolism to Parkinson's disease.</a> Advanced Biology. 5 (9), 2100663 (2021).</li><li>Dauer, W., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease:+mechanisms+and+models.">Parkinson's disease: mechanisms and models.</a> Neuron. 39 (6), 889-909 (2003).</li><li>Moratalla, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+vulnerability+of+primate+caudate-putamen+and+striosome-matrix+dopamine+systems+to+the+neurotoxic+effects+of+1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-+tetrahydropyridine.">Differential vulnerability of primate caudate-putamen and striosome-matrix dopamine systems to the neurotoxic effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- tetrahydropyridine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (9), 3859-3863 (1992).</li><li>Cheng, H. -. C., Ulane, C. M., Burke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+progression+in+Parkinson+disease+and+the+neurobiology+of+axons.">Clinical progression in Parkinson disease and the neurobiology of axons.</a> Annals of Neurology. 67 (6), 715-725 (2010).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury,+regeneration+and+transport.">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).</li><li>Harbauer, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+mitochondria+transport+Pink1+mRNA+via+synaptojanin+2+to+support+local+mitophagy.">Neuronal mitochondria transport Pink1 mRNA via synaptojanin 2 to support local mitophagy.</a> Neuron. 110 (9), 1516-1531 (2022).</li><li>Ashrafi, G., Schlehe, J. S., LaVoie, M. J., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+of+damaged+mitochondria+occurs+locally+in+distal+neuronal+axons+and+requires+PINK1+and+Parkin.">Mitophagy of damaged mitochondria occurs locally in distal neuronal axons and requires PINK1 and Parkin.</a> Journal of Cell Biology. 206 (5), 655-670 (2014).</li><li>Shipman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine&#235;thanesulfonic+acid+(HEPES)+as+a+tissue+culture+buffer.">Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine&#235;thanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 130 (1), 305-310 (1969).</li><li>Harbauer, A. B., Schneider, A., Wohlleber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondria+by+single-organelle+resolution.">Analysis of mitochondria by single-organelle resolution.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 15, 1-16 (2022).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+mRNA+in+uninjured+and+regenerating+cortical+mammalian+axons.">Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (15), 4697-4707 (2009).</li><li>Altman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+TDP-43+condensates+drive+neuromuscular+junction+disruption+through+inhibition+of+local+synthesis+of+nuclear+encoded+mitochondrial+proteins.">Axonal TDP-43 condensates drive neuromuscular junction disruption through inhibition of local synthesis of nuclear encoded mitochondrial proteins.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).</li></ol>

El presente protocolo describe un método para sembrar y cultivar neuronas disociadas del hipocampo en un dispositivo microfluídico para tratar las mitocondrias axonales por separado. La utilidad de este enfoque con el colorante sensible a la membrana TMRE y el inhibidor del complejo III Antimicina A (como se demostró anteriormente7) se demuestra aquí, pero este método puede adaptarse fácilmente a otros colorantes mitocondriales o sensores codificados genéticamente de funciones mitocondriale...

Las mitocondrias son los principales proveedores de ATP (trifosfato de adenosina) en las neuronas. Como la salud neuronal está íntimamente ligada a la función mitocondrial, no es sorprendente que la regulación disfuncional de estos orgánulos se haya asociado con la aparición de diversas enfermedades neurodegenerativas, incluida la enfermedad de Parkinson1. Además, la intoxicación mitocondrial se ha utilizado con éxito para modelar los síntomas parkinsonianos en animales2. Tanto en modelos animales como en enfermedades humanas, la desaparición de las neuronas comienza en las partes distales3,4, lo que sugiere que las mitocondrias axonales podrían ser más susceptibles a los insultos. Sin embargo, la biología de las mitocondrias en los axones no se comprende bien debido a las dificultades asociadas con el tratamiento dirigido y el análisis de las mitocondrias axonales sin perturbación simultánea de los procesos del cuerpo celular.
Los recientes avances en las técnicas de cultivo de neuronas disociadas in vitro permiten ahora la separación fluídica de axones y cuerpos celulares a través de dispositivos microfluídicos5. Como se muestra en la Figura 1A, estos dispositivos cuentan con cuatro pozos de acceso (a/h y c/i), con dos canales que conectan cada par (d y f). Los canales grandes están conectados entre sí por una serie de microcanales de 450 μm de largo (e). Las diferencias intencionales en los niveles de llenado entre las dos cámaras crean un gradiente de presión de fluido (Figura 1B) que evita la difusión de moléculas pequeñas desde el canal con un nivel de fluido más bajo hacia el otro lado (Figura 1C, ilustrada con colorante azul de tripano).
Recientemente utilizamos dispositivos microfluídicos para estudiar los requisitos de traducción local en la mitofagia axonal, la eliminación selectiva de las mitocondrias dañadas6. En el presente protocolo, se presentan diferentes pasos para inducir daño mitocondrial local a través del tratamiento selectivo de los axones utilizando el inhibidor del complejo mitocondrial III Antimicina A 6,7.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well Glass bottom plate</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06.1.5H-N</td>
			<td>Silicone device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS M5000 widefield microscope</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td>EVOS M5000</td>
			<td>fully integrated digital widefield microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibernate E</td>
			<td>BrainBits</td>
			<td>HE500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted spinning disk confocal</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TI2-E + CSU-W1</td>
			<td>With incubator chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic devices</td>
			<td>XONA microfluidics</td>
			<td>RD450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRE</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>87917</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidics-assisted selective depolarization of axonal mitochondria

Las mitocondrias son los principales proveedores de ATP (trifosfato de adenosina) en las neuronas. La disfunción mitocondrial es un fenotipo común en muchas enfermedades neurodegenerativas. Dada la elaborada arquitectura y la longitud extrema de algunos axones, no es sorprendente que las mitocondrias en los axones puedan experimentar diferentes entornos en comparación con sus contrapartes del cuerpo celular. Curiosamente, la disfunción de las mitocondrias axonales a menudo precede a los efectos en el cuerpo celular. Para modelar la disfunción mitocondrial axonal in vitro, los dispositivos microfluídicos permiten el tratamiento de las mitocondrias axonales sin afectar a las mitocondrias somales. El gradiente de presión fluídica en estas cámaras evita la difusión de moléculas contra el gradiente, lo que permite el análisis de las propiedades mitocondriales en respuesta a los desafíos farmacológicos locales dentro de los axones. El protocolo actual describe la siembra de neuronas disociadas del hipocampo en dispositivos microfluídicos, la tinción con un tinte sensible al potencial de membrana, el tratamiento con una toxina mitocondrial y el posterior análisis microscópico. Este método versátil para estudiar la biología axonal se puede aplicar a muchas perturbaciones farmacológicas y lecturas de imágenes, y es adecuado para varios subtipos neuronales.

Las neuronas primarias del hipocampo se cultivaron en dispositivos microfluídicos durante 7-8 días antes de que las mitocondrias se tiñeran con el tinte sensible a la membrana (TMRE) durante 25 minutos en ambos canales. Como se muestra en la Figura 2A, esto produjo una tinción homogénea de las mitocondrias en ambos lados de los microsurcos, pero fue insuficiente para equilibrar la tinción en el medio de los microsurcos. Tras la adición de antimicina A al lado axonal, las mitocondrias ...

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Microfluidics-Assisted Selective Depolarization of Axonal Mitochondria

El presente protocolo describe la siembra y tinción de mitocondrias neuronales en cámaras microfluídicas. El gradiente de presión fluídica en estas cámaras permite el tratamiento selectivo de las mitocondrias en los axones para analizar sus propiedades en respuesta a desafíos farmacológicos sin afectar el compartimento del cuerpo celular.

Despolarización selectiva asistida por microfluídica de mitocondrias axonales

Mitochondria are the primary suppliers of ATP (adenosine triphosphate) in neurons. Mitochondrial dysfunction is a common phenotype in many ...

Las mitocondrias son esenciales para la salud neuronal. En muchas enfermedades neurodegenerativas, las mitocondrias axonales son las primeras en sufrir, pero no está claro qué hace que las mitocondrias axonales sean tan especiales. El gradiente de presión fluídica en las cámaras utilizadas en este protocolo permite el tratamiento selectivo de los axones mitocondriales.Esto deja los procesos del cuerpo celular intactos y nos permite centrarnos en la biología axonal. Mostramos aquí la despolarización de las mitocondrias con un colorante sensible al potencial de membrana, pero este método se puede aplicar a muchos tipos diferentes de células neuronales y lecturas fluorescentes. Para comenzar, coloque las placas codificadas de seis pozos en una campana estéril y lávelas dos veces con agua estéril de doble destilación.Deje que las placas se sequen en una posición inclinada durante tres a cinco minutos. Elimine el exceso de agua mediante succión al vacío o pipeteo. Luego remoje la cámara microfluídica en etanol al 80%.Una vez más, seque la cámara microfluídica durante tres a cinco minutos en posición inclinada y elimine el exceso de etanol con una punta de pipeta. Cuando esté completamente seco, coloque la cámara microfluídica en el centro del pozo y la placa. Golpee suavemente la cámara microfluídica en sus bordes y la sección de microranura en el centro para una fijación adecuada a la placa de vidrio.Primero, recoja el número deseado de neuronas disociadas del hipocampo en un tubo de reacción de 1.5 mililitros. Centrifugar el tubo a 1000 veces G durante cuatro minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en ocho microlitros de medios neurobasales B-27.Luego dispense la solución celular en la entrada del canal de la cámara microfluídica. Toque la parte posterior de la placa para ayudar al flujo a través del canal. Usando una pipeta, aspirar cualquier suspensión celular restante a la salida del canal.Incubar la cámara microfluídica con células durante 15 a 20 minutos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. A continuación, llene el pozo axonal superior con 50 microlitros de medios neurobasales B-27 y toque la parte posterior de la placa para ayudar al flujo. Llene cada pocillo en el lado del soma con 150 microlitros de medios neurobasales B-27, creando una burbuja de tensión en la parte superior.También llenar ambos pocillos del lado axonal con 100 microlitros de medios neurobasales B-27 cada uno. Después de siete a ocho días de cultivo in vitro, asegúrese de que los axones hayan crecido a través de los microsurcos y se hayan extendido al compartimiento axonal. Lave el dispositivo retirando el medio neurobasal B-27 y agregando 100 microlitros de medio de imagen precalentado a los pocillos superiores de los canales axonal y soma.Deje que el medio fluya a través de los pozos inferiores. Retire el medio de los pocillos inferiores y cualquier medio sobrante de los pocillos superiores, y repita con un medio fresco, dejando los pocillos vacíos al final del lavado. Luego agregue 100 microlitros de dilución TMRE de cinco nanomolares a los pocillos superiores somáticos y axonales.Deje que el medio fluya a través de ambos compartimentos, hasta que haya un volumen igual en todos los pozos. Llene con el medio que contiene TMRE. Seleccione una región de interés en el compartimento somático y sígala a través de los microsurcos hasta el compartimiento axonal.Asegúrese de que las microranuras fotografiadas en los compartimentos somático y axonal coincidan entre sí. Después de cambiar el nombre del archivo, adquiera imágenes de fluorescencia roja utilizando una excitación de 561 nanómetros y longitudes de onda de emisión de 625 nanómetros. Asegure una diferencia de volumen entre el soma y las cámaras axonales comprobando la presencia de una burbuja de tensión en el lado somático.Luego retire el medio de imagen de ambos pocillos del lado axonal, excepto del medio dentro del canal. Para inducir la despolarización mitocondrial, agregue 160 microlitros de 20 micromolares antimicina A diluida en el medio de imagen al pocillo axonal superior. Deje que fluya a través del canal hasta que haya un volumen igual en ambos pocillos axonales.Repita las imágenes, asegurándose de que se obtengan las mismas posiciones que durante la adquisición de referencia, identificando los microsurcos. Usando este protocolo, las neuronas primarias del hipocampo se cultivaron en dispositivos microfluídicos, seguidas de tinción mitocondrial con un colorante sensible a la membrana, TMRE. Se observó una tinción homogénea de las mitocondrias en ambos lados de los microsurcos, pero no en el medio.Tras la adición de antimicina A al lado axonal, las mitocondrias somales retuvieron la señal TMRE, mientras que la fluorescencia se perdió de las mitocondrias axonales. Asegúrese de que no quede humedad en el pozo o en el dispositivo antes de ensamblar el dispositivo. De lo contrario, las cámaras no estarán selladas. Utilizando este método, podemos estudiar los efectos de la pérdida de la función mitocondrial en el axón y las funciones locales, así como su influencia en la señalización retrógrada y la supervivencia celular global.Durante mucho tiempo se pensó que la biogénesis mitocondrial ocurría exclusivamente en el cuerpo celular. Este método nos permitió revelar que el daño axonal de las mitocondrias requería la traducción local de la proteína PINK1.

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