Name: microfluidics-assisted selective depolarization of axonal mitochondria
Uploaded: 2022-08-04T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidics-Assisted Selective Depolarization of Axonal Mitochondria at JoVE.com

Denna studie stöddes av den tyska forskningsstiftelsen (HA 7728/2-1 och EXC2145 Project ID 390857198) och Max Planck Society.

Alla djurförsök utfördes i enlighet med relevanta riktlinjer och föreskrifter från regeringen i Oberbayern. De primära neuronerna framställdes från E16.5 C57BL/6 musembryon av båda könen enligt standardmetoder som tidigare beskrivits6.
1. Montering av mikrofluidikanordningen
<ol><li>Täck en vävnadsodlingsplatta med sex brunnar med glasbotten med en slutlig koncentration på 20 μg/ml poly-D-lysin och 3,4 μg/ml laminin i PBS (fosfatbuffrad...

<ol>
	<li>Murali Mahadevan, H., Hashemiaghdam, A., Ashrafi, G., Harbauer, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+neuronal+health:+from+energy+metabolism+to+Parkinson's+disease.">Mitochondria in neuronal health: from energy metabolism to Parkinson's disease.</a> Advanced Biology. 5 (9), 2100663 (2021).</li><li>Dauer, W., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease:+mechanisms+and+models.">Parkinson's disease: mechanisms and models.</a> Neuron. 39 (6), 889-909 (2003).</li><li>Moratalla, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+vulnerability+of+primate+caudate-putamen+and+striosome-matrix+dopamine+systems+to+the+neurotoxic+effects+of+1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-+tetrahydropyridine.">Differential vulnerability of primate caudate-putamen and striosome-matrix dopamine systems to the neurotoxic effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- tetrahydropyridine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (9), 3859-3863 (1992).</li><li>Cheng, H. -. C., Ulane, C. M., Burke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+progression+in+Parkinson+disease+and+the+neurobiology+of+axons.">Clinical progression in Parkinson disease and the neurobiology of axons.</a> Annals of Neurology. 67 (6), 715-725 (2010).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury,+regeneration+and+transport.">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).</li><li>Harbauer, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+mitochondria+transport+Pink1+mRNA+via+synaptojanin+2+to+support+local+mitophagy.">Neuronal mitochondria transport Pink1 mRNA via synaptojanin 2 to support local mitophagy.</a> Neuron. 110 (9), 1516-1531 (2022).</li><li>Ashrafi, G., Schlehe, J. S., LaVoie, M. J., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+of+damaged+mitochondria+occurs+locally+in+distal+neuronal+axons+and+requires+PINK1+and+Parkin.">Mitophagy of damaged mitochondria occurs locally in distal neuronal axons and requires PINK1 and Parkin.</a> Journal of Cell Biology. 206 (5), 655-670 (2014).</li><li>Shipman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine&#235;thanesulfonic+acid+(HEPES)+as+a+tissue+culture+buffer.">Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine&#235;thanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 130 (1), 305-310 (1969).</li><li>Harbauer, A. B., Schneider, A., Wohlleber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondria+by+single-organelle+resolution.">Analysis of mitochondria by single-organelle resolution.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 15, 1-16 (2022).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+mRNA+in+uninjured+and+regenerating+cortical+mammalian+axons.">Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (15), 4697-4707 (2009).</li><li>Altman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+TDP-43+condensates+drive+neuromuscular+junction+disruption+through+inhibition+of+local+synthesis+of+nuclear+encoded+mitochondrial+proteins.">Axonal TDP-43 condensates drive neuromuscular junction disruption through inhibition of local synthesis of nuclear encoded mitochondrial proteins.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).</li></ol>

Detta protokoll beskriver en metod för att fröa och odla dissocierade hippocampusneuroner i en mikrofluidisk anordning för att behandla axonala mitokondrier separat. Nyttan av detta tillvägagångssätt med det membrankänsliga färgämnet TMRE och den komplexa III-hämmaren Antimycin A (som tidigare visats7) demonstreras här, men denna metod kan enkelt anpassas till andra mitokondriella färgämnen eller genetiskt kodade sensorer av mitokondriella funktioner som möjliggör lokala, mikroskopi...

Mitokondrier är de viktigaste leverantörerna av ATP (adenosintrifosfat) i neuroner. Eftersom neuronal hälsa är intimt kopplad till mitokondriell funktion är det inte förvånande att dysfunktionell reglering av dessa organeller har associerats med uppkomsten av olika neurodegenerativa sjukdomar, inklusive Parkinsons sjukdom1. Dessutom har mitokondriell förgiftning framgångsrikt använts för att modellera Parkinsons symtom hos djur2. I både djurmodeller och mänsklig sjukdom börjar neurons bortgång vid de distala delarna3,4, vilket antyder att axonala mitokondrier kan vara mer mottagliga för förolämpningar. Mitokondriernas biologi i axoner är emellertid inte väl förstådd på grund av svårigheterna i samband med riktad behandling och analys av axonala mitokondrier utan samtidig störning av cellkroppsprocesser.
De senaste framstegen inom odlingstekniker för dissocierade neuroner in vitro tillåter nu fluidisk separation av axoner och cellkroppar genom mikrofluidiska anordningar5. Som visas i figur 1A har dessa enheter fyra åtkomstbrunnar (a / h och c / i), med två kanaler som förbinder varje par (d och f). De stora kanalerna är förbundna med varandra med en serie av 450 μm långa mikrokanaler (e). Avsiktliga skillnader i fyllningsnivåerna mellan de två kamrarna skapar en vätsketrycksgradient (figur 1B) som förhindrar diffusion av små molekyler från kanalen med en lägre vätskenivå till andra sidan (figur 1C, illustrerad med trypanblått färgämne).
Vi använde nyligen mikrofluidiska enheter för att studera lokala översättningskrav i axonal mitophagi, selektivt avlägsnande av skadade mitokondrier6. I detta protokoll presenteras olika steg för att inducera lokal mitokondriell skada genom selektiv behandling av axoner med användning av mitokondriell komplex III-hämmare Antimycin A 6,7.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well Glass bottom plate</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06.1.5H-N</td>
			<td>Silicone device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS M5000 widefield microscope</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td>EVOS M5000</td>
			<td>fully integrated digital widefield microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibernate E</td>
			<td>BrainBits</td>
			<td>HE500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted spinning disk confocal</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TI2-E + CSU-W1</td>
			<td>With incubator chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic devices</td>
			<td>XONA microfluidics</td>
			<td>RD450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRE</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>87917</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidics-assisted selective depolarization of axonal mitochondria

Mitokondrier är de primära leverantörerna av ATP (adenosintrifosfat) i nervceller. Mitokondriell dysfunktion är en vanlig fenotyp vid många neurodegenerativa sjukdomar. Med tanke på vissa axoners utarbetade arkitektur och extrema längd är det inte förvånande att mitokondrier i axoner kan uppleva olika miljöer jämfört med deras motsvarigheter i cellkroppen. Intressant är att dysfunktion av axonala mitokondrier ofta föregår effekter på cellkroppen. För att modellera axonal mitokondriell dysfunktion in vitro tillåter mikrofluidiska anordningar behandling av axonala mitokondrier utan att påverka de somala mitokondrierna. Den fluidiska tryckgradienten i dessa kamrar förhindrar diffusion av molekyler mot gradienten, vilket möjliggör analys av mitokondriella egenskaper som svar på lokala farmakologiska utmaningar inom axoner. Det nuvarande protokollet beskriver sådd av dissocierade hippocampusneuroner i mikrofluidiska anordningar, färgning med ett membranpotentialkänsligt färgämne, behandling med ett mitokondriellt toxin och den efterföljande mikroskopiska analysen. Denna mångsidiga metod för att studera axonal biologi kan tillämpas på många farmakologiska störningar och avbildningsavläsningar och är lämplig för flera neuronala subtyper.

Primära hippocampusneuroner odlades i mikrofluidiska enheter i 7-8 dagar innan mitokondrier färgades med det membrankänsliga färgämnet (TMRE) i 25 minuter i båda kanalerna. Som visas i figur 2A gav detta homogen färgning av mitokondrier på båda sidor av mikrospåren, men det var otillräckligt för att balansera färgningen i mitten av mikrospåren. Vid tillsats av antimycin A till axonalsidan behöll somala mitokondrier TMRE-signalen (figur 2B och vide...

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidics-Assisted Selective Depolarization of Axonal Mitochondria at JoVE.com

Microfluidics-Assisted Selective Depolarization of Axonal Mitochondria

Detta protokoll beskriver sådd och färgning av neuronala mitokondrier i mikrofluidiska kamrar. Den fluidiska tryckgradienten i dessa kamrar möjliggör selektiv behandling av mitokondrier i axoner för att analysera deras egenskaper som svar på farmakologiska utmaningar utan att påverka cellkroppsfacket.

Mikrofluidikassisterad selektiv depolarisering av axonala mitokondrier

Mitochondria are the primary suppliers of ATP (adenosine triphosphate) in neurons. Mitochondrial dysfunction is a common phenotype in many ...

Mitokondrier är viktiga för neuronal hälsa. I många neurodegenerativa sjukdomar är axonala mitokondrier de första som lider, men det är inte klart vad som gör axonala mitokondrier så speciella. Den fluidiska tryckgradienten i kamrarna som används i detta protokoll möjliggör selektiv behandling av mitokondrionaxoner.Detta lämnar cellkroppsprocesser ostörda och låter oss fokusera på axonal biologi. Vi visar här depolariseringen av mitokondrier med ett membranpotentialkänsligt färgämne, men denna metod kan tillämpas på många olika neuronala celltyper och fluorescerande avläsningar. För att börja, placera de kodade sex brunnsplattorna i en steril huva och tvätta dem två gånger med sterilt dubbeldestillerat vatten.Låt plattorna torka i lutat läge i tre till fem minuter. Ta bort överflödigt vatten genom vakuumsugning eller pipettering. Blötlägg sedan mikrofluidikkammaren i 80% etanol.Torka igen den mikrofluidiska kammaren i tre till fem minuter i ett lutat läge och ta bort överskott av etanol med en pipettspets. När den är helt torr, placera den mikrofluidiska kammaren i mitten av brunnen och plattan. Knacka försiktigt på mikrofluidikkammaren vid dess gränser och mikrogroovesektionen i mitten för korrekt fastsättning på glasplattan.Samla först det önskade antalet dissocierade hippocampusneuroner i ett 1, 5 ml reaktionsrör. Centrifugera röret vid 1000 gånger G i fyra minuter vid rumstemperatur. Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i åtta mikroliter B-27 neurobasala medier.Dosera sedan celllösningen i kanalingången till den mikrofluidiska kammaren. Tryck på baksidan av plattan för att hjälpa flödet genom kanalen. Använd en pipett och aspirera eventuell återstående cellsuspension vid kanalens utgång.Inkubera den mikrofluidiska kammaren med celler i 15 till 20 minuter vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid. Fyll sedan den övre axonala brunnen med 50 mikroliter B-27 neurobasala medier och tryck på baksidan av plattan för att hjälpa flödet. Fyll varje brunn på soma-sidan med 150 mikroliter B-27 neurobasala medier, vilket skapar en spänningsbubbla ovanpå.Fyll också båda brunnarna på axonalsidan med 100 mikroliter B-27 neurobasala medier vardera. Efter sju till åtta dagars in vitro-odling, se till att axonerna har vuxit genom mikrospåren och sträckts ut i axonalfacket. Tvätta enheten genom att ta bort B-27 neurobasala mediet och tillsätt 100 mikroliter förvärmt bildmedium till de övre brunnarna i både axonal- och somakanalerna.Låt mediet strömma igenom till de nedre brunnarna. Ta bort mediet från de nedre brunnarna och eventuellt kvarvarande medium från de övre brunnarna och upprepa med nytt medium och lämna brunnarna tomma i slutet av tvätten. Tillsätt sedan 100 mikroliter fem nanomolära TMRE-utspädningar till både de somatiska och axonala toppbrunnarna.Låt mediet strömma genom båda facken tills det finns lika stor volym i alla brunnar. Fyll på med TMRE-innehållande medium. Välj en region av intresse i det somatiska facket och följ det genom mikrospåren in i axonalfacket.Se till att mikrospåren som avbildas i de somatiska och axonala facken är matchade med varandra. Efter att ha ändrat filnamnet, skaffa röda fluorescensbilder med 561 nanometer excitation och 625 nanometer emissionsvåglängder. Säkerställ en volymskillnad mellan soma och axonala kamrar genom att kontrollera närvaron av en spänningsbubbla på den somatiska sidan.Ta sedan bort bildmediet från båda brunnarna på axonalsidan, förutom mediet inuti kanalen. För att inducera mitokondriell depolarisering, tillsätt 160 mikroliter 20 mikromolära antimycin A utspädda i bildmediet till den övre axonala brunnen. Låt det strömma genom kanalen tills det finns lika stor volym i båda axonala brunnarna.Upprepa avbildningen och se till att samma positioner avbildas som under baslinjeförvärvet genom att identifiera mikrospåren. Med hjälp av detta protokoll odlades primära hippocampusneuroner i mikrofluidiska anordningar, följt av mitokondriell färgning med ett membrankänsligt färgämne, TMRE. Homogen färgning av mitokondrier observerades på båda sidor av mikrospåren, men inte i mitten.Vid tillsats av antimycin A till axonalsidan behöll somala mitokondrier TMRE-signalen, medan fluorescensen förlorades från axonala mitokondrier Se till att ingen fukt finns kvar i brunnen eller på enheten innan du monterar enheten. Annars kommer kamrarna inte att förseglas. Med hjälp av denna metod kan vi studera effekterna av förlust av mitokondriell funktion i axon- och lokala funktioner, liksom dess inverkan på retrograd signalering och global cellöverlevnad.Mitokondriell biogenes ansågs länge ske uteslutande i cellkroppen. Denna metod gjorde det möjligt för oss att avslöja att axonal mitokondrier skada krävde lokal översättning av kortet av proteinet PINK1.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mechanical Manipulation of Neurons to Control Axonal Development

Mekanisk Manipulation av nervceller till Control axonal utveckling

Cell manipulations and extension of neuronal axons can be accomplished with calibrated glass micro-fibers capable of measuring and applying forces in the ...

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Kromatin Immunoprecipitation från dorsalrotsganglier vävnad efter axonal skada

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Elektroporering av hindbrain att spåra axonal Trajectories och Synaptic Mål i Chick Embryo

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

Selektiv spåra Auditiva fibrer i Avian embryonala Vestibulocochlear Nerve

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

Subtypselektiva Elektroporering av kortikal Interneuroner

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

Realtid avbildning av axonal transport av Quantum Dot-märkta BDNF i primära neuroner

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

Characterizing the Composition of Molecular Motors on Moving Axonal Cargo Using "Cargo Mapping" Analysis

Karakterisera sammansättning Molecular Motors på Moving axonal Cargo Använda &quot;Cargo Mapping&quot; Analys

Understanding the mechanisms by which molecular motors coordinate their activities to transport vesicular cargoes within neurons requires the quantitative ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

Tredimensionell avbildning och analys av mitokondrier inom mänskliga Intraepidermal nervfibrer

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Analys av Brain Mitokondrier Använda Serial Block-Face Svepelektronmikroskopi

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualisering av Axonal Projektionsmönstret av Embryonic Motor Neurons in<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...