Name: microfluidics-assisted selective depolarization of axonal mitochondria
Uploaded: 2022-08-04T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidics-Assisted Selective Depolarization of Axonal Mitochondria at JoVE.com

Bu çalışma Alman Araştırma Vakfı (HA 7728/2-1 ve EXC2145 Proje Kimliği 390857198) ve Max Planck Derneği tarafından desteklenmiştir.

Tüm hayvan deneyleri, Yukarı Bavyera Hükümeti'nin ilgili yönergeleri ve düzenlemeleri uyarınca gerçekleştirilmiştir. Primer nöronlar, daha önce tarif edildiği gibi standart yöntemler izlenerek her iki cinsiyetten E16.5 C57BL / 6 vahşi tip fare embriyolarından hazırlandı6.
1. Mikroakışkan cihazın montajı
<ol><li>PBS'de (fosfat tamponlu salin) 20 μg / mL Poli-D-Lizin ve 3.4 μg / mL Laminin nihai konsantrasyonu ile altı kuyucuklu...

<ol>
	<li>Murali Mahadevan, H., Hashemiaghdam, A., Ashrafi, G., Harbauer, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+neuronal+health:+from+energy+metabolism+to+Parkinson's+disease.">Mitochondria in neuronal health: from energy metabolism to Parkinson's disease.</a> Advanced Biology. 5 (9), 2100663 (2021).</li><li>Dauer, W., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease:+mechanisms+and+models.">Parkinson's disease: mechanisms and models.</a> Neuron. 39 (6), 889-909 (2003).</li><li>Moratalla, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+vulnerability+of+primate+caudate-putamen+and+striosome-matrix+dopamine+systems+to+the+neurotoxic+effects+of+1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-+tetrahydropyridine.">Differential vulnerability of primate caudate-putamen and striosome-matrix dopamine systems to the neurotoxic effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- tetrahydropyridine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (9), 3859-3863 (1992).</li><li>Cheng, H. -. C., Ulane, C. M., Burke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+progression+in+Parkinson+disease+and+the+neurobiology+of+axons.">Clinical progression in Parkinson disease and the neurobiology of axons.</a> Annals of Neurology. 67 (6), 715-725 (2010).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury,+regeneration+and+transport.">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).</li><li>Harbauer, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+mitochondria+transport+Pink1+mRNA+via+synaptojanin+2+to+support+local+mitophagy.">Neuronal mitochondria transport Pink1 mRNA via synaptojanin 2 to support local mitophagy.</a> Neuron. 110 (9), 1516-1531 (2022).</li><li>Ashrafi, G., Schlehe, J. S., LaVoie, M. J., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+of+damaged+mitochondria+occurs+locally+in+distal+neuronal+axons+and+requires+PINK1+and+Parkin.">Mitophagy of damaged mitochondria occurs locally in distal neuronal axons and requires PINK1 and Parkin.</a> Journal of Cell Biology. 206 (5), 655-670 (2014).</li><li>Shipman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine&#235;thanesulfonic+acid+(HEPES)+as+a+tissue+culture+buffer.">Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine&#235;thanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 130 (1), 305-310 (1969).</li><li>Harbauer, A. B., Schneider, A., Wohlleber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondria+by+single-organelle+resolution.">Analysis of mitochondria by single-organelle resolution.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 15, 1-16 (2022).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+mRNA+in+uninjured+and+regenerating+cortical+mammalian+axons.">Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (15), 4697-4707 (2009).</li><li>Altman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+TDP-43+condensates+drive+neuromuscular+junction+disruption+through+inhibition+of+local+synthesis+of+nuclear+encoded+mitochondrial+proteins.">Axonal TDP-43 condensates drive neuromuscular junction disruption through inhibition of local synthesis of nuclear encoded mitochondrial proteins.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).</li></ol>

Mevcut protokol, aksonal mitokondrileri ayrı ayrı tedavi etmek için mikroakışkan bir cihazda ayrışmış hipokampal nöronları tohumlamak ve kültürlemek için bir yöntemi açıklamaktadır. Bu yaklaşımın membrana duyarlı boya TMRE ve kompleks III inhibitörü Antimisin A (daha önce gösterildiği gibi7) ile faydası burada gösterilmiştir, ancak bu yöntem diğer mitokondriyal boyalara veya lokal, mikroskopi tabanlı okumalara izin veren mitokondriyal fonksiyonların genetik olarak...

Mitokondri, nöronlardaki ATP'nin (adenozin trifosfat) ana tedarikçileridir. Nöronal sağlık mitokondriyal fonksiyonla yakından bağlantılı olduğundan, bu organellerin işlevsiz düzenlenmesinin Parkinson hastalığı1 de dahil olmak üzere çeşitli nörodejeneratif hastalıkların başlangıcı ile ilişkili olması şaşırtıcı değildir. Ayrıca, mitokondriyal zehirlenme, hayvanlarda Parkinson semptomlarını modellemek için başarıyla kullanılmıştır2. Hem hayvan modellerinde hem de insan hastalığında, nöronların ölümü distal kısımlar 3,4'te başlar ve aksonal mitokondrinin hakaretlere daha duyarlı olabileceğini ima eder. Bununla birlikte, aksonlardaki mitokondrinin biyolojisi, hücre gövdesi süreçlerinin eşzamanlı olarak bozulması olmadan aksonal mitokondrinin hedeflenen tedavisi ve analizi ile ilgili zorluklar nedeniyle iyi anlaşılmamıştır.
Ayrışmış nöronların in vitro kültürleme tekniklerindeki son gelişmeler artık mikroakışkan cihazlar aracılığıyla aksonların ve hücre cisimlerinin akışkan olarak ayrılmasına izin vermektedir5. Şekil 1A'da gösterildiği gibi, bu cihazlar her bir çifti (d ve f) birbirine bağlayan iki kanala sahip dört erişim kuyusuna (a / s ve c / i) sahiptir. Büyük kanallar birbirine 450 μm uzunluğundaki bir dizi mikro kanal (e) ile bağlanır. İki oda arasındaki dolum seviyelerindeki kasıtlı farklılıklar, küçük moleküllerin daha düşük sıvı seviyesine sahip kanaldan diğer tarafa difüzyonunu önleyen bir sıvı basınç gradyanı oluşturur (Şekil 1B) (Şekil 1C, Tripan mavisi boya ile gösterilmiştir).
Son zamanlarda, aksonal mitofajideki yerel çeviri gereksinimlerini, hasarlı mitokondri 6'nın seçici olarak uzaklaştırılmasını incelemek için mikroakışkan cihazlarkullandık. Bu protokolde, mitokondriyal kompleks III inhibitörü Antimisin A 6,7 kullanılarak aksonların seçici tedavisi yoluyla lokal mitokondriyal hasarı indüklemek için farklı adımlar sunulmuştur.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well Glass bottom plate</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06.1.5H-N</td>
			<td>Silicone device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS M5000 widefield microscope</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td>EVOS M5000</td>
			<td>fully integrated digital widefield microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibernate E</td>
			<td>BrainBits</td>
			<td>HE500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted spinning disk confocal</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TI2-E + CSU-W1</td>
			<td>With incubator chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic devices</td>
			<td>XONA microfluidics</td>
			<td>RD450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRE</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>87917</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidics-assisted selective depolarization of axonal mitochondria

Mitokondri, nöronlardaki ATP'nin (adenozin trifosfat) birincil tedarikçileridir. Mitokondriyal disfonksiyon birçok nörodejeneratif hastalıkta sık görülen bir fenotiptir. Bazı aksonların ayrıntılı mimarisi ve aşırı uzunluğu göz önüne alındığında, aksonlardaki mitokondrilerin hücre gövdesindeki meslektaşlarına kıyasla farklı ortamlar yaşayabilmesi şaşırtıcı değildir. İlginç bir şekilde, aksonal mitokondrinin işlev bozukluğu genellikle hücre gövdesi üzerindeki etkilerden önce gelir. Aksonal mitokondriyal disfonksiyonu in vitro olarak modellemek için, mikroakışkan cihazlar somal mitokondrileri etkilemeden aksonal mitokondrinin tedavisine izin verir. Bu odalardaki akışkan basınç gradyanı, moleküllerin gradyana karşı difüzyonunu önler, böylece aksonlar içindeki lokal farmakolojik zorluklara yanıt olarak mitokondriyal özelliklerin analizine izin verir. Mevcut protokol, ayrışmış hipokampal nöronların mikroakışkan cihazlarda tohumlanmasını, membran potansiyeline duyarlı bir boya ile boyanmasını, mitokondriyal toksin ile tedaviyi ve ardından mikroskobik analizi açıklamaktadır. Aksonal biyolojiyi incelemek için bu çok yönlü yöntem, birçok farmakolojik pertürbasyona ve görüntüleme okumalarına uygulanabilir ve çeşitli nöronal alt tipler için uygundur.

Primer hipokampal nöronlar, mitokondrilerin her iki kanalda da 25 dakika boyunca membrana duyarlı boya (TMRE) ile boyanmasından önce 7-8 gün boyunca mikroakışkan cihazlarda yetiştirildi. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, bu, mikroolukların her iki tarafında homojen mitokondri boyanmasına neden oldu, ancak boyamayı mikro olukların ortasına dengelemek için yetersizdi. Aksonal tarafa Antimisin A eklenmesi üzerine, somal mitokondri TMRE sinyalini korudu (Şekil <strong class="xfi...

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidics-Assisted Selective Depolarization of Axonal Mitochondria at JoVE.com

Microfluidics-Assisted Selective Depolarization of Axonal Mitochondria

Mevcut protokol, nöronal mitokondrinin mikroakışkan odalarda tohumlanmasını ve boyanmasını tanımlamaktadır. Bu odalardaki akışkan basınç gradyanı, aksonlardaki mitokondrilerin, hücre gövdesi bölmesini etkilemeden farmakolojik zorluklara yanıt olarak özelliklerini analiz etmek için seçici tedavisine izin verir.

Aksonal Mitokondrinin Mikroakışkanlar Yardımlı Seçici Depolarizasyonu

Mitochondria are the primary suppliers of ATP (adenosine triphosphate) in neurons. Mitochondrial dysfunction is a common phenotype in many ...

Mitokondri nöronal sağlık için gereklidir. Birçok nörodejeneratif hastalıkta, aksonal mitokondri ilk acı çekenlerdir, ancak aksonal mitokondrileri bu kadar özel kılan şeyin ne olduğu açık değildir. Bu protokolde kullanılan odalardaki akışkan basınç gradyanı, mitokondri aksonlarının seçici tedavisine izin verir.Bu, hücre gövdesi süreçlerini rahatsız etmeden bırakır ve aksonal biyolojiye odaklanmamızı sağlar. Burada membran potansiyeline duyarlı bir boya ile mitokondrinin depolarizasyonunu gösteriyoruz, ancak bu yöntem birçok farklı nöronal hücre tipine ve floresan okumalarına uygulanabilir. Başlamak için, kodlanmış altı kuyucuk plakasını steril bir davlumbaza yerleştirin ve steril çift damıtılmış suyla iki kez yıkayın.Plakaların üç ila beş dakika boyunca eğimli bir konumda kurumasını bekleyin. Fazla suyu vakum emme veya pipetleme ile temizleyin. Daha sonra mikroakışkan odayı% 80 etanol içine batırın.Yine, mikroakışkan odayı eğimli bir konumda üç ila beş dakika kurutun ve fazla etanolün pipet ucuyla çıkarılmasını sağlayın. Tamamen kuruduğunda, mikroakışkan odayı kuyunun ve plakanın ortasına yerleştirin. Cam plakaya düzgün bir şekilde tutturulması için kenarlıklarındaki mikroakışkan haznesine ve ortasındaki mikro oluk bölümüne hafifçe dokunun.İlk olarak, 1.5 mililitrelik bir reaksiyon tüpünde istenen sayıda ayrışmış hipokampal nöron toplayın. Tüpü oda sıcaklığında dört dakika boyunca 1000 kez G'de santrifüj yapın. Süpernatanı atın ve peleti sekiz mikrolitre B-27 nöro bazal ortamda yeniden askıya alın.Daha sonra hücre çözeltisini mikroakışkan odanın kanal girişine dağıtın. Kanaldan akışa yardımcı olmak için plakanın arkasına dokunun. Bir pipet kullanarak, kanalın çıkışında kalan hücre süspansiyonunu aspire edin.Mikroakışkan odasını hücrelerle 15 ila 20 dakika boyunca 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Daha sonra, üst aksonal kuyuyu 50 mikrolitre B-27 nörobazal medya ile doldurun ve akışa yardımcı olmak için plakanın arkasına dokunun. Soma tarafındaki her bir kuyucuğu 150 mikrolitre B-27 nörobazal medya ile doldurun ve üstte bir gerilim kabarcığı oluşturun.Ayrıca aksonal tarafın her iki kuyusunu da her biri 100 mikrolitre B-27 nörobazal medya ile doldurun. Yedi ila sekiz günlük in vitro kültürden sonra, aksonların mikro oluklardan büyüdüğünden ve aksonal bölmeye uzandığından emin olun. B-27 nörobazal ortamını çıkararak ve hem aksonal hem de soma kanallarının üst kuyucuklarına 100 mikrolitre önceden ısıtılmış görüntüleme ortamı ekleyerek cihazı yıkayın.Ortamın alt kuyucuklara akmasına izin verin. Ortamı alt kuyucuklardan ve kalan herhangi bir ortamı üst kuyucuklardan çıkarın ve yıkamanın sonunda kuyucukları boş bırakarak taze ortamla tekrarlayın. Daha sonra hem somatik hem de aksonal üst kuyucuklara 100 mikrolitre beş nanomolar TMRE seyreltme ekleyin.Tüm kuyucuklarda eşit bir hacim olana kadar ortamın her iki bölmeden de akmasına izin verin. TMRE içeren ortamla doldurun. Somatik bölmede ilgilendiğiniz bir bölge seçin ve mikro oluklardan aksonal bölmeye kadar takip edin.Somatik ve aksonal bölmelerde görüntülenen mikro olukların birbiriyle eşleştiğinden emin olun. Dosya adını değiştirdikten sonra, 561 nanometre uyarma ve 625 nanometre emisyon dalga boylarını kullanarak kırmızı floresan görüntüleri elde edin. Somatik tarafta bir gerilim kabarcığının varlığını kontrol ederek soma ve aksonal odalar arasında hacim farkı sağlayın.Ardından, görüntüleme ortamını, kanalın içindeki ortam hariç, aksonal tarafın her iki kuyucuğundan çıkarın. Mitokondriyal depolarizasyonu indüklemek için, görüntüleme ortamında seyreltilmiş 160 mikrolitre 20 mikromolar antimisin A üst aksonal kuyuya ekleyin. Her iki aksonal kuyuda eşit hacim olana kadar kanaldan akmasına izin verin.Mikro olukları tanımlayarak, temel alma sırasında olduğu gibi aynı konumların görüntülendiğinden emin olarak görüntülemeyi tekrarlayın. Bu protokolü kullanarak, birincil hipokampal nöronlar mikroakışkan cihazlarda yetiştirildi, ardından membrana duyarlı bir boya olan TMRE ile mitokondriyal boyama yapıldı. Mitokondrinin homojen boyanması, mikro olukların her iki tarafında gözlendi, ancak ortada gözlenmedi.Aksonal tarafa antimisin A eklenmesi üzerine, somal mitokondri TMRE sinyalini korurken, floresan aksonal Mitokondriden kayboldu Cihazı monte etmeden önce kuyuda veya cihazda nem kalmadığından emin olun. Aksi takdirde, odalar kapatılmayacaktır. Bu yöntemi kullanarak, akson ve lokal fonksiyonlardaki mitokondriyal fonksiyon kaybının etkilerinin yanı sıra retrograd sinyalizasyon ve küresel hücre sağkalımı üzerindeki etkisini inceleyebiliriz.Mitokondriyal biyogenezin uzun zamandır sadece hücre gövdesinde gerçekleştiği düşünülüyordu. Bu yöntem, aksonal mitokondri hasarının, PINK1 proteininin eksikliğinin lokal çevirisini gerektirdiğini ortaya koymamızı sağladı.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mechanical Manipulation of Neurons to Control Axonal Development

Nöronlar Aksonal Geliştirme Kontrol Mekanik Manipülasyon

Cell manipulations and extension of neuronal axons can be accomplished with calibrated glass micro-fibers capable of measuring and applying forces in the ...

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Kromatin Aksonal Yaralanma Dorsal Kök Ganglia Doku Immunoprecipitation

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Civciv Embriyo aksonal Yörüngeler ve Synaptic Hedefler Trace için Beyin elektroporasyon

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

Kuş Embriyonik vestibülokoklear sinir İşitsel Elyaf seçici Aydınger

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

Kortikal internöronlar alt tip-selektif Elektroporasyon

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

Quantum Akson Ulaştırma Gerçek zamanlı Görüntüleme İlköğretim Nöronlar BDNF Dot-etiketli

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

Characterizing the Composition of Molecular Motors on Moving Axonal Cargo Using "Cargo Mapping" Analysis

Kullanımı Akson Kargo Hareketli Moleküler Motors Kompozisyon karakterize &quot;Kargo Haritalama&quot; Analizi

Understanding the mechanisms by which molecular motors coordinate their activities to transport vesicular cargoes within neurons requires the quantitative ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

Üç boyutlu görüntüleme ve mitokondri içinde insan Intraepidermal sinir lifleri analizi

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Seri Blok-Yüz Taramalı Elektron Mikroskop Kullanarak Beyin Mitokondri Analizi

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Embriyonik Motor Nöronlarının Aksonal Projeksiyon Paterninin Görselleştirilmesi<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...