Name: preparation of cytoplasmic and nuclear long rnas from primary and cultured cells
Uploaded: 2023-04-07T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Cytoplasmic and Nuclear Long RNAs from Primary and Cultured Cells at JoVE.com

Ondersteund door subsidies van de American Society of Hematology, de Robert Wood Johnson Foundation, de Doris Duke Charitable Foundation, de Edward P. Evans Foundation en het National Cancer Institute (1K08CA230319).

K562-cellen worden gebruikt voor deze studie. Dit protocol is geoptimaliseerd om te werken voor 1 x 106-5 x 106 miljoen cellen. De procedure kan echter worden opgeschaald voor grotere celhoeveelheden door de volumes op de juiste manier te verhogen.
1. Voorbereiding van de 0,25x lysisbuffer
<ol><li>Bereid 0,25x lysisbuffer voor door de volgende componenten in tabel 1A te mengen. OPMERKING: Monsters vereisen ongeveer 300 μL van 0,25x ...

<ol>
	<li>Conrad, T., Orom, U. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+fractionation+and+isolation+of+chromatin-associated+RNA.">Cellular fractionation and isolation of chromatin-associated RNA.</a> Methods in Molecular Biology. 1468, 1-9 (2017).</li><li>Bashirullah, A., Cooperstock, R. L., Lipshitz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+localization+in+development.">RNA localization in development.</a> Annual Review of Biochemistry. 67, 335-394 (1998).</li><li>Liu, X., Fagotto, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+separate+nuclear,+cytosolic,+and+membrane-associated+signaling+molecules+in+cultured+cells.">A method to separate nuclear, cytosolic, and membrane-associated signaling molecules in cultured cells.</a> Science Signaling. 4 (203), (2011).</li><li>Jansen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+localization:+message+on+the+move.">mRNA localization: message on the move.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (4), 247-256 (2001).</li><li>Carlevaro-Fita, J., Johnson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+positioning+system:+Understanding+long+noncoding+RNAs+through+subcellular+localization.">Global positioning system: Understanding long noncoding RNAs through subcellular localization.</a> Molecular Cell. 73 (5), 869-883 (2019).</li><li>Voit, E. O., Martens, H. A., Omholt, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=150+years+of+the+mass+action+law.">150 years of the mass action law.</a> PLOS Computational Biology. 11 (1), 1004012 (2015).</li><li>El-Tanani, M., Dakir el, H., Raynor, B., Morgan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+nuclear+export+in+cancer+and+resistance+to+chemotherapy.">Mechanisms of nuclear export in cancer and resistance to chemotherapy.</a> Cancers (Basel). 8 (3), 35 (2016).</li><li>Turner, J. G., Dawson, J., Sullivan, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+export+of+proteins+and+drug+resistance+in+cancer).">Nuclear export of proteins and drug resistance in cancer).</a> Biochemical Pharmacology. 83 (8), 1021-1032 (2012).</li><li>Boesenberg-Smith, K. A., Pessarakli, M. M., Wolk, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+DNA+yield+and+purity:+an+overlooked+detail+of+PCR+troubleshooting.">Assessment of DNA yield and purity: an overlooked detail of PCR troubleshooting.</a> Clinical Microbiology Newsletter. 34 (1), 1-6 (2012).</li><li>Taylor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+nuclear+export+signal+recognition+as+a+driver+of+oncogenesis+altered+nuclear+export+signal+recognition+drives+oncogenesis.">Altered nuclear export signal recognition as a driver of oncogenesis altered nuclear export signal recognition drives oncogenesis.</a> Cancer Discovery. 9 (10), 1452-1467 (2019).</li><li>Ayupe, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+biogenesis,+stability+and+sub-cellular+localization+of+lncRNAs+mapping+to+intragenic+regions+of+the+human+genome.">Global analysis of biogenesis, stability and sub-cellular localization of lncRNAs mapping to intragenic regions of the human genome.</a> RNA Biology. 12 (8), 877-892 (2015).</li><li>Ghuysen, J. -. M., Hakenbeck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacterial Cell Wall. , (1994).</li><li>Fersht, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Enzyme Structure and Mechanism. , (1985).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> How to win the battle with RNase. 2019 (2), (2019).</li><li>Blumberg, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+a+ribonuclease-free+environment.">Creating a ribonuclease-free environment.</a> Methods in Enzymology. 152, 20-24 (1987).</li><li>Abmayr, S. M., Yao, T., Parmely, T., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+nuclear+and+cytoplasmic+extracts+from+mammalian+cells.">Preparation of nuclear and cytoplasmic extracts from mammalian cells.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2006).</li><li>Taylor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selinexor,+a+first-in-class+XPO1+inhibitor,+is+efficacious+and+tolerable+in+patients+with+myelodysplastic+syndromes+refractory+to+hypomethylating+agents.">Selinexor, a first-in-class XPO1 inhibitor, is efficacious and tolerable in patients with myelodysplastic syndromes refractory to hypomethylating agents.</a> Blood. 132, 233 (2018).</li></ol>

Gedurende het protocol werden enkele stappen ondernomen om de elementen te optimaliseren om het meest effectief te zijn voor de cellijn van belang. Hoewel de stappen binnen het protocol relatief eenvoudig zijn, kunnen analyse en kleine aanpassingen tijdens kritieke aspecten van het protocol nodig zijn. De meest kritische stap in het protocol is het wijzigen van de concentratie van de lysisbuffer tot een juiste concentratie op basis van de cellijn van belang en het cellulaire doelwit. Aangezien het gebruik van lysisbuffer...

Cellulaire fractionering in subcellulaire componenten maakt de isolatie en studie van gedefinieerde biochemische domeinen mogelijk en helpt bij het bepalen van de lokalisatie van specifieke cellulaire processen en hoe dit hun functie kan beïnvloeden1. Isolatie van RNA van verschillende intracellulaire locaties kan zorgen voor een verbeterde nauwkeurigheid van genetische en biochemische analyse van transcriptieniveaugebeurtenissen en andere interacties tussen de kern en het cytoplasma, wat dient als het primaire doel van het huidige protocol2. Dit protocol is ontwikkeld om de isolatie van cytoplasmatische en nucleaire RNA's te garanderen om hun respectieve rollen in nucleaire export te bepalen en om te begrijpen hoe de subcellulaire lokalisatie van RNA's in de kern en het cytoplasma hun functie in cellulaire processen kan beïnvloeden. Met behulp van materialen uit een typische laboratoriumomgeving was het mogelijk om nucleaire en cytoplasmatische fractionering effectiever en goedkoper te bereiken dan eerder vastgestelde protocollen zonder de kwaliteit van de resultaten in gevaar te brengen3.
Bovendien kan de uitwisseling van moleculen tussen het cytoplasma en de kern direct worden bestudeerd door deze regio's te scheiden. Meer specifiek is het begrijpen van het transcriptoom essentieel voor het begrijpen van ontwikkeling en ziekte. RNA's kunnen zich echter op elk moment op verschillende rijpingsniveaus bevinden en kunnen de downstream-analyse bemoeilijken. Dit protocol maakt het mogelijk om RNA te isoleren uit nucleaire en cytoplasmatische subcellulaire fracties, wat kan helpen bij studies van RNA en een beter begrip van een bepaald RNA van belang mogelijk maakt, zoals de lokalisatie van niet-coderende RNA's of analyse van splice junctions binnen de kern.
Dit protocol is geoptimaliseerd voor het isoleren van cytoplasmatische en nucleaire lange RNA's, waaronder mRNA's, rRNA's en lange niet-coderende RNA's (lncRNA's), vanwege de grootteselectiviteit van de gebruikte RNA-zuiveringskolom, die kan worden gewijzigd om andere RNA's van belang te isoleren. Voorheen was de functie van lange RNA's, zoals mRNA's en lncRNA's, sterk afhankelijk van hun respectieve lokalisatie binnen de cel 4,5. Daarom is de studie van de export van de kern naar subcellulaire domeinen meer gericht op het begrijpen van de rol die het exporteren van RNA of andere cellulaire componenten op de cel kan hebben. lncRNA's dienen als een goed voorbeeld hiervan, omdat hun vertaling en daaropvolgende effecten grotendeels afhankelijk zijn van nabijheid en interacties met andere vormen van RNA6. Bovendien is de uitwisseling van cellulaire elementen tussen nucleaire en cytoplasmatische regio's gekoppeld aan resistentiemechanismen tegen verschillende kankerbehandelingen7. De isolatie van intracellulaire compartimenten heeft de ontwikkeling van nucleaire exportremmers mogelijk gemaakt, wat de effecten van resistentiemechanismen tegen verschillende therapieën heeft verminderd8.
Na het scheiden van nucleair en cytoplasmatisch RNA worden stappen uitgevoerd om het RNA van belang te zuiveren. Omdat RNA-zuiveringskits vaak worden aangetroffen in laboratoria en functioneren om lange RNA's te zuiveren en te isoleren, dienen ze het doel van dit protocol goed. Voor RNA-zuivering is het genereren van 260:280-verhoudingen groter dan 1,8 van cruciaal belang om de kwaliteit van monsters voor RNA-sequencing of andere soortgelijke procedures te waarborgen die een hoge mate van zuiverheid en isolatie vereisen. Onregelmatige 260:280-waarden wijzen op fenolbesmetting, die een slechte isolatie aantonen en onnauwkeurige resultaten opleveren9.
Zodra de RNA-zuivering is voltooid en 260:280-waarden boven een acceptabel bereik liggen, werd qPCR gebruikt om de isolatieresultaten van nucleaire en cytoplasmatische fracties te valideren. Daarbij werden primers gebruikt die specifiek zijn voor het interessegebied om de nucleaire en cytoplasmatische fractioneringsniveaus aan te tonen. In dit protocol werden MALAT1 en TUG1 gebruikt als nucleaire en cytoplasmatische markers, respectievelijk10. Samen maken ze het mogelijk om hoge niveaus van nucleaire fractionering met MALAT1 aan te tonen, terwijl cytoplasmatische fractionering naar verwachting laag zal zijn. Omgekeerd, wanneer TUG1 wordt gebruikt, wordt verwacht dat cytoplasmatische fractioneringsniveaus hoger zijn dan nucleaire fractioneringsniveaus.
Met behulp van dit protocol was het mogelijk om RNA's te isoleren op basis van hun positie van actie in de cel. Vanwege de wijdverspreide toegang tot veel materialen en het gebruik van alleen lysisbuffer- en op dichtheid gebaseerde centrifugatietechnieken tijdens dit experiment, is de toepasbaarheid op andere RNA-typen en andere cellulaire componenten wijdverspreid. Dit kan belangrijke informatie opleveren door licht te werpen op locatiespecifieke expressiegebeurtenissen die anders zonder scheiding niet van elkaar te onderscheiden zouden zijn.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agilent Tapestation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991BA</td>
			<td>The Agilent TapeStation system is an automated electrophoresis solution for the sample quality control of DNA and RNA samples.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Nonidet P-40</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>28324</td>
			<td>Used in the making of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mM Tris-Cl pH 8.0</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>15568025</td>
			<td>Used in the making of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALAT1 GE Assay</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>Hs00273907_s1</td>
			<td>Utilized for confirmation of Nuclear fraction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>4326659</td>
			<td>The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>4311971</td>
			<td>The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate during qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012-023</td>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) is a balanced salt solution that is used for a variety of cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue samples, diluting cells for counting, and preparing reagents.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen RNA Clean Up Kit-Rneasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td>RNA cleanup kits enable efficient RNA cleanup of enzymatic reactions and cleanup of RNA purified by different methods. Includes RW1, RLT, RW1 buffers mentioned throughout protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>A43180</td>
			<td>qPCR software utilized during protocol. Includes Design and Analysis Software for analyzing fractionation samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RLT Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>Lysis Buffer from RNA clean-up kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPE Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1018013</td>
			<td>Wash Buffer from RNA clean-up kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RW1 Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1053394</td>
			<td>Wash Buffer from RNA clean-up kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman Gene Expression Assays</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays represent the largest collection of predesigned assays in the industry with over 2.8 million assays across 32 eukaryotic species and numerous microbes. TaqMan Gene Expression assays enable you to get results fast with no time wasted optimizing SYBR Green primers and no extra time spent running and analyzing melt curves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>4305719</td>
			<td>TaqMan Universal PCR Master Mix is the ideal reagent solution when you need a master mix for multiple 5&#39; nuclease DNA applications. Applied Biosystems reagents have been validated with TaqMan assays and Applied Biosystems real-time systems to ensure sensitive, accurate, and reliable performance every time.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUG1 GE Assay</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>Hs00215501_m1</td>
			<td>Utilized for confirmation of Cytoplasmic fraction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DEPC-Treated Water</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>750024</td>
			<td>UltraPure DEPC-treated Water is suitable for use with RNA. It is prepared by incubating with 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC), and is then autoclaved to remove the DEPC. Sterile filtered.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of cytoplasmic and nuclear long rnas from primary and cultured cells

De scheiding van intracellulaire componenten is al vele jaren een belangrijk hulpmiddel in de cellulaire biologie en heeft nuttig inzicht kunnen geven in hoe hun locatie hun functie kan beïnvloeden. In het bijzonder is de scheiding van nucleair en cytoplasmatisch RNA belangrijk geworden in de context van kankercellen en de zoektocht naar nieuwe doelen voor geneesmiddelen. Het kopen van kits voor nucleair-cytoplasmatische RNA-extractie kan duur zijn wanneer veel van de vereiste materialen te vinden zijn in een typische laboratoriumomgeving. Met behulp van de huidige methode, die duurdere kits of andere tijdrovende processen kan vervangen, zijn alleen een zelfgemaakte lysisbuffer, een benchtopcentrifuge en RNA-isolatiezuiveringskolommen nodig om nucleair en cytoplasmatisch RNA te isoleren. Lysisbuffer wordt gebruikt om het buitenmembraan van de cel zachtjes te lyseren zonder de integriteit van de nucleaire envelop aan te tasten, waardoor de intracellulaire componenten kunnen worden vrijgegeven. Vervolgens kunnen de kernen worden geïsoleerd door een eenvoudige centrifugatiestap, omdat ze een hogere dichtheid hebben dan de lysisoplossing. Centrifugatie wordt gebruikt om deze gebieden te scheiden op basis van hun dichtheidsverschillen om subcellulaire elementen in de kern te isoleren van die in het cytoplasma. Zodra de centrifugatie de verschillende componenten heeft geïsoleerd, wordt een RNA-opruimkit gebruikt om het RNA-gehalte te zuiveren en wordt qPCR uitgevoerd om de scheidingskwaliteit te valideren, gekwantificeerd door de hoeveelheid nucleair en cytoplasmatisch RNA in de verschillende fracties. Statistisch significante niveaus van scheiding werden bereikt, wat de effectiviteit van het protocol illustreert. Bovendien kan dit systeem worden aangepast voor de isolatie van verschillende soorten RNA (totaal, klein RNA, enz.), Wat gerichte bestudering van cytoplasma-nucleusinteracties mogelijk maakt en helpt bij het begrijpen van de verschillen in de functie van RNA die zich in de kern en het cytoplasma bevinden.

Om er zeker van te zijn dat nucleaire en cytoplasmatische isolatie was bereikt, werd een qPCR uitgevoerd om de resultaten te valideren. Daarbij werden primers gebruikt die specifiek zijn voor het gebied van belang om de nucleaire en cytoplasmatische fractioneringsniveaus aan te tonen. In deze studie werden MALAT1 en TUG1 gebruikt als respectievelijk nucleaire en cytoplasmatische primers. Samen maken ze het mogelijk om hoge niveaus van nucleaire fractionering aan te tonen met MALAT1 als een positieve controle voor nucleai...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Cytoplasmic and Nuclear Long RNAs from Primary and Cultured Cells at JoVE.com

Preparation of Cytoplasmic and Nuclear Long RNAs from Primary and Cultured Cells

Het huidige protocol biedt een efficiënte en flexibele methode om RNA te isoleren uit nucleaire en cytoplasmatische fracties met behulp van gekweekte cellen en vervolgens te valideren met behulp van qPCR. Dit dient effectief als vervanging voor andere RNA-voorbereidingskits.

Bereiding van cytoplasmatische en nucleaire lange RNA's uit primaire en gekweekte cellen

The separation of intracellular components has been a key tool in cellular biology for many years now and has been able to provide useful insight into how ...

Dit protocol is nodig om de verschillende rollen van gedefinieerde biochemische elementen in de kern en het cytoplasma te evalueren en om intracellulaire interacties tussen deze domeinen binnen verschillende cellijnen te analyseren. Deze techniek maakt gebruik van alledaagse laboratoriumapparatuur en reagentia om de cytoplasmatische en nucleaire fracties efficiënter te scheiden. Dit protocol kan dit goedkoper en sneller doen dan andere protocollen.Naarmate studies over cytoplasmatische en nucleaire interacties wijdverspreider worden, kan de impact van lokalisatie op intracellulaire gebeurtenissen beter worden begrepen. De uitwisseling tussen het cytoplasma en de kern kan worden geanalyseerd, wat aangeeft of bepaalde moleculen tijdens deze uitwisselingen kunnen leiden tot de ontwikkeling van kanker, zoals studies over nucleaire eiwitten hebben aangetoond. De meest kritische stap in het protocol is het aanpassen van de concentratie van de lysisbuffer naar een juiste concentratie.Omdat het gebruik van lysisbuffer grotendeels afhankelijk is van de verstoring van celmembranen en er natuurlijke varianten zijn in de effectiviteit van lysisbuffer op verschillende cellijnen. Om te beginnen, pellet de cellen, met behulp van 1,5 milliliter buizen via centrifugatie gedurende vijf minuten op 2000 G.Gooi het supernatant weg met behulp van een aanzuigende pipet. Resuspendeerde de pellet in 300 microliter ijskoude lysisbuffer.Draai vervolgens de buizen met een snelheid van ongeveer 12.000 G bij vier graden Celsius gedurende twee minuten. Verwijder het supernatant voorzichtig en plaats het in een nieuwe buis van 1,5 milliliter. De resterende pellet zal de kernfractie zijn.Voeg vervolgens 500 microliter ijskoude PBS toe aan de pellet en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 2000 G bij kamertemperatuur. Om de scheiding van de compartimenten met qPCR te bevestigen, zet u eerst het RNA om in complementair DNA met behulp van een in de handel verkrijgbare kit. Bereid reverse transcriptase master mix voor.Voeg sjabloon-RNA toe. Incubeer reacties in een thermocycler. Ga verder voor het uitvoeren van kwantitatieve polymerasekettingreactie en -analyse.Begin met het verdunnen van de cDNA-synthese met DEPC-water om een uiteindelijke concentratie van 20 nanogram per milliliter te hebben. Bereid met behulp van een PCR-mastermix de reactie voor elk monster voor met behulp van handmatige instructies. Verkrijg commerciële sondes die nodig zijn om cytoplasmatische en nucleaire fractionering te detecteren.Gebruik MALAT1 als nucleaire marker en TUG1 als cytoplasmatische marker. Bereken het volume van elke component door elke component met drie te vermenigvuldigen voor elk van de technische replicaties voor het individuele monster. Verkrijg voor elk nucleair en cytoplasmatisch monster de mengsels kernfractie met MALAT1, cytoplasmatische fractie met MALAT1, kernfractie met TUG1 en cytoplasmatische fractie met TUG1.Vortex kort om oplossingen te mengen en 20 microliter van het mengsel over te brengen naar elke put van een optische reactieplaat. Bedek de plaat met een heldere kleeffilm die wordt gebruikt voor qPCR en centrifugeer de plaat kort om luchtbellen te verwijderen en draai het monster vervolgens gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur op 300 keer G. Selecteer met behulp van ontwerp- en analysesoftware de standaardcurve voor de fietsparameters.Gebruik qPCR-software en selecteer setup run. Selecteer op de eigenschappenpagina van het gegevensbestand de optie methode- en invoercyclusparameters. Nadat u cyclusparameters hebt ingevoerd, selecteert u het plaattabblad en voert u de monsters in die moeten worden uitgevoerd.Selecteer start run. Nadat de uitvoering is voltooid, maakt u een gegevensspreadsheet met de voorbeeldnaam, doelnaam en kwantificeringscyclus. Begin met de MALAT1-monsters om de kernfractie te berekenen.Trek de MALAT1 cytoplasmatische fractie af van de MALAT1 kernfractie. Ga verder met de MALAT1-monsters om de cytoplasmatische fractie te berekenen. Trek MALAT1 kernfractie af van MALAT1 cytoplasmatische fractie en bereken vervolgens de twee verhoogd tot negatieve delta CQ. Voer de berekeningen uit met TUG1-monsters.Wanneer TUG1 aanwezig is als een positieve controle voor cytoplasmatische elementen, zullen de cytoplasmatische fractioneringsniveaus naar verwachting hoger zijn dan nucleaire fractioneringsniveaus. Een negatief resultaat waarbij niveaus van cytoplasmatische fractionering worden waargenomen in het monster met MALAT1. Dit duidt op besmetting van RNA geïsoleerd uit de kernfractie, mogelijk als gevolg van lysisconcentraties die te laag of te hoog zijn.MALAT1 en TUG1 vertoonden de hoogste correlatie met nucleaire en cytoplasmatische scheiding zoals bevestigd door een Western blot en RNA-elektroforese, die de zuiverheid en kwaliteit van de monsters bevestigde. Bovendien kan de zuiverheid van nucleaire en cytoplasmatische extracten worden aangetoond door een Western blot met lamin als marker voor kernfractie en alfa-tubuline als positieve marker voor de cytoplasmatische fractie. Er werd geen piek waargenomen in de cytoplasmatische RNA-elektroforese, wat een hoge kwaliteit en weinig of geen contaminatie in het cytoplasmatische RNA-monster aantoonde.Het gebruik van lysisbuffer is van cruciaal belang voor een goede fractionering en het optimaliseren van de lysisbufferconcentratie tot de gewenste cellijn van belang is essentieel. Deze techniek maakt de gerichte studie van nucleaire en cytoplasmatische interactie mogelijk, die breed toepasbaar is op een verscheidenheid aan onderzoeksonderwerpen en zorgt voor een beter begrip van hoe lokalisatie van specifieke biologische elementen kan correleren met hun functie.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood

Capture and Release van levensvatbare circulerende tumorcellen van Blood

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Voorbereiding en metabole kwantitatieve analyse van 3-dimensionale sferoïde co culturen van Pancreatic kankercellen en fibroblasten

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

Ontwikkeling van een menselijke preklinische Model van Osteoclastogenesis uit perifeer bloed monocyten mede gekweekt met borst kanker cellijnen

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

Voorbereiding van primaire Acute lymfatische leukemie cellen in verschillende celcyclus fasen door centrifugaal Elutriation

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

Karakterisering van tumorcellen met behulp van een medische draad voor het vastleggen van de circulerende tumorcellen: een 3D aanpak gebaseerd op immunofluorescentie en DNA vis

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

An Orthotopic Endometrial Cancer Model with Retroperitoneal Lymphadenopathy Made From In Vivo Propagated and Cultured VX2 Cells

Een Orthothematisch endometriumkanker model met Retroperitoneale lymfadenopathie gemaakt van in vivo gepropageerd en gekweekte VX2 cellen

Endometrial cancer is the most common gynecologic malignancy in North America and the incidence is rising worldwide. Treatment consists of surgery with or ...

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Extractie van waterige metabolieten van gekweekte aanhang cellen voor Metabolomic analyse door capillaire elektroforese-massaspectrometrie

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

Subcellulaire fractionering van primaire chronische lymfatische leukemie cellen om te controleren van nucleaire/cytoplasmatische eiwit handel

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Immunofluorescentie beeldvorming van DNA Schade en Reparatie Foci in human Colon Kankercellen

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Measurement of the Compressibility of Cell and Nucleus Based on Acoustofluidic Microdevice

Meting van de samendrukbaarheid van cel en kern op basis van Acoustofluidic Microdevice

Cell mechanics play an important role in tumor metastasis, malignant transformation of cells, and radiosensitivity. During these processes, studying the ...