Name: preparation of cytoplasmic and nuclear long rnas from primary and cultured cells
Uploaded: 2023-04-07T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Cytoplasmic and Nuclear Long RNAs from Primary and Cultured Cells at JoVE.com

Unterstützt durch Zuschüsse der American Society of Hematology, der Robert Wood Johnson Foundation, der Doris Duke Charitable Foundation, der Edward P. Evans Foundation und des National Cancer Institute (1K08CA230319).

Für die vorliegende Studie werden K562-Zellen verwendet. Dieses Protokoll wurde für 1 x 10,6-5 x 10,6 Millionen Zellen optimiert. Das Verfahren kann jedoch für größere Zellmengen skaliert werden, indem die Volumina entsprechend erhöht werden.
1. Herstellung des 0,25-fachen Lysepuffers
<ol><li>Bereiten Sie 0,25-fachen Lysepuffer vor, indem Sie die folgenden Komponenten in Tabelle 1A mischen. HINWEIS: Für die Proben werden ca. 3...

<ol>
	<li>Conrad, T., Orom, U. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+fractionation+and+isolation+of+chromatin-associated+RNA.">Cellular fractionation and isolation of chromatin-associated RNA.</a> Methods in Molecular Biology. 1468, 1-9 (2017).</li><li>Bashirullah, A., Cooperstock, R. L., Lipshitz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+localization+in+development.">RNA localization in development.</a> Annual Review of Biochemistry. 67, 335-394 (1998).</li><li>Liu, X., Fagotto, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+separate+nuclear,+cytosolic,+and+membrane-associated+signaling+molecules+in+cultured+cells.">A method to separate nuclear, cytosolic, and membrane-associated signaling molecules in cultured cells.</a> Science Signaling. 4 (203), (2011).</li><li>Jansen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+localization:+message+on+the+move.">mRNA localization: message on the move.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (4), 247-256 (2001).</li><li>Carlevaro-Fita, J., Johnson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+positioning+system:+Understanding+long+noncoding+RNAs+through+subcellular+localization.">Global positioning system: Understanding long noncoding RNAs through subcellular localization.</a> Molecular Cell. 73 (5), 869-883 (2019).</li><li>Voit, E. O., Martens, H. A., Omholt, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=150+years+of+the+mass+action+law.">150 years of the mass action law.</a> PLOS Computational Biology. 11 (1), 1004012 (2015).</li><li>El-Tanani, M., Dakir el, H., Raynor, B., Morgan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+nuclear+export+in+cancer+and+resistance+to+chemotherapy.">Mechanisms of nuclear export in cancer and resistance to chemotherapy.</a> Cancers (Basel). 8 (3), 35 (2016).</li><li>Turner, J. G., Dawson, J., Sullivan, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+export+of+proteins+and+drug+resistance+in+cancer).">Nuclear export of proteins and drug resistance in cancer).</a> Biochemical Pharmacology. 83 (8), 1021-1032 (2012).</li><li>Boesenberg-Smith, K. A., Pessarakli, M. M., Wolk, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+DNA+yield+and+purity:+an+overlooked+detail+of+PCR+troubleshooting.">Assessment of DNA yield and purity: an overlooked detail of PCR troubleshooting.</a> Clinical Microbiology Newsletter. 34 (1), 1-6 (2012).</li><li>Taylor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+nuclear+export+signal+recognition+as+a+driver+of+oncogenesis+altered+nuclear+export+signal+recognition+drives+oncogenesis.">Altered nuclear export signal recognition as a driver of oncogenesis altered nuclear export signal recognition drives oncogenesis.</a> Cancer Discovery. 9 (10), 1452-1467 (2019).</li><li>Ayupe, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+biogenesis,+stability+and+sub-cellular+localization+of+lncRNAs+mapping+to+intragenic+regions+of+the+human+genome.">Global analysis of biogenesis, stability and sub-cellular localization of lncRNAs mapping to intragenic regions of the human genome.</a> RNA Biology. 12 (8), 877-892 (2015).</li><li>Ghuysen, J. -. M., Hakenbeck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacterial Cell Wall. , (1994).</li><li>Fersht, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Enzyme Structure and Mechanism. , (1985).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> How to win the battle with RNase. 2019 (2), (2019).</li><li>Blumberg, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+a+ribonuclease-free+environment.">Creating a ribonuclease-free environment.</a> Methods in Enzymology. 152, 20-24 (1987).</li><li>Abmayr, S. M., Yao, T., Parmely, T., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+nuclear+and+cytoplasmic+extracts+from+mammalian+cells.">Preparation of nuclear and cytoplasmic extracts from mammalian cells.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2006).</li><li>Taylor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selinexor,+a+first-in-class+XPO1+inhibitor,+is+efficacious+and+tolerable+in+patients+with+myelodysplastic+syndromes+refractory+to+hypomethylating+agents.">Selinexor, a first-in-class XPO1 inhibitor, is efficacious and tolerable in patients with myelodysplastic syndromes refractory to hypomethylating agents.</a> Blood. 132, 233 (2018).</li></ol>

Während des gesamten Protokolls wurden einige Schritte unternommen, um die Elemente so zu optimieren, dass sie für die interessierende Zelllinie am effektivsten sind. Während die Schritte innerhalb des Protokolls relativ einfach sind, können Analysen und kleinere Anpassungen bei kritischen Aspekten des Protokolls erforderlich sein. Der kritischste Schritt im Protokoll besteht darin, die Konzentration des Lysepuffers auf eine geeignete Konzentration zu ändern, die auf der interessierenden Zelllinie und dem zelluläre...

Die zelluläre Fraktionierung in subzelluläre Komponenten ermöglicht die Isolierung und Untersuchung definierter biochemischer Domänen und hilft bei der Bestimmung der Lokalisierung spezifischer zellulärer Prozesse und wie sich dies auf ihre Funktion auswirken kann1. Die Isolierung von RNA an verschiedenen intrazellulären Stellen kann eine verbesserte Genauigkeit der genetischen und biochemischen Analyse von Ereignissen auf Transkriptionsebene und anderen Wechselwirkungen zwischen dem Zellkern und dem Zytoplasma ermöglichen, was als Hauptzweck des aktuellen Protokolls2 dient. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die Isolierung von zytoplasmatischen und nukleären RNAs sicherzustellen, um ihre jeweilige Rolle beim Kernexport zu bestimmen und zu verstehen, wie die subzelluläre Lokalisation von RNAs im Zellkern und im Zytoplasma ihre Funktion in zellulären Prozessen beeinflussen kann. Durch die Verwendung von Materialien aus einer typischen Laborumgebung war es möglich, eine nukleare und zytoplasmatische Fraktionierung effektiver und kostengünstiger als bisher etablierte Protokolle zu erreichen, ohne die Qualität der Ergebnisse zu gefährden3.
Darüber hinaus kann der Austausch von Molekülen zwischen dem Zytoplasma und dem Zellkern direkt untersucht werden, indem diese Regionen getrennt werden. Genauer gesagt ist das Verständnis des Transkriptoms für das Verständnis von Entwicklung und Krankheit unerlässlich. RNAs können sich jedoch zu einem bestimmten Zeitpunkt in unterschiedlichen Reifegraden befinden und die nachgelagerte Analyse erschweren. Dieses Protokoll ermöglicht die Isolierung von RNA aus nukleären und zytoplasmatischen subzellulären Fraktionen, was bei RNA-Studien hilfreich sein und ein besseres Verständnis einer bestimmten RNA von Interesse ermöglichen kann, wie z. B. die Lokalisierung nicht-kodierender RNAs oder die Analyse von Spleißverbindungen innerhalb des Zellkerns.
Dieses Protokoll wurde für die Isolierung zytoplasmatischer und nukleärer langer RNAs, einschließlich mRNAs, rRNAs und langer nicht-kodierender RNAs (lncRNAs), aufgrund der Größenselektivität der verwendeten RNA-Aufreinigungssäule optimiert, die modifiziert werden kann, um andere RNAs von Interesse zu isolieren. Bisher hing die Funktion langer RNAs, wie mRNAs und lncRNAs, stark von ihrer jeweiligen Lokalisation innerhalb der Zelleab 4,5. Daher ist die Untersuchung des Exports vom Zellkern in subzelluläre Domänen gezielter geworden, um die Rolle zu verstehen, die der Export von RNA oder anderen zellulären Komponenten auf die Zelle haben kann. lncRNAs dienen als Paradebeispiel dafür, da ihre Translation und ihre nachfolgenden Effekte weitgehend von der Nähe und den Wechselwirkungen mit anderen Formen von RNA6 abhängen. Darüber hinaus ist der Austausch zellulärer Elemente zwischen nukleären und zytoplasmatischen Regionen mit Resistenzmechanismen gegen verschiedene Krebsbehandlungen verbunden7. Die Isolierung intrazellulärer Kompartimente hat die Entwicklung von Kernexportinhibitoren ermöglicht, was die Auswirkungen von Resistenzmechanismen gegen verschiedene Therapien verringert hat8.
Nach der Trennung von nukleärer und zytoplasmatischer RNA werden Schritte durchgeführt, um die interessierende RNA zu reinigen. Da RNA-Aufreinigungskits häufig in Laboratorien zu finden sind und lange RNAs reinigen und isolieren, erfüllen sie den Zweck dieses Protokolls gut. Für die RNA-Aufreinigung ist die Erzeugung eines Verhältnisses von 260:280 von mehr als 1,8 entscheidend, um die Qualität der Proben für die RNA-Sequenzierung oder andere ähnliche Verfahren zu gewährleisten, die ein hohes Maß an Reinheit und Isolierung erfordern. Unregelmäßige Werte von 260:280 deuten auf eine Phenolkontamination hin, was auf eine schlechte Isolierung hinweist und zu ungenauen Ergebnissen führt9.
Sobald die RNA-Aufreinigung abgeschlossen ist und bestätigt wurde, dass die 260:280-Werte über einem akzeptablen Bereich liegen, wurde die qPCR verwendet, um die Isolationsergebnisse von Kern- und zytoplasmatischen Fraktionen zu validieren. Dabei wurden Primer verwendet, die für die interessierende Region spezifisch sind, um die nuklearen und zytoplasmatischen Fraktionierungsniveaus zu demonstrieren. In diesem Protokoll wurden MALAT1 und TUG1 als nukleäre bzw. zytoplasmatische Marker verwendet10. Zusammen ermöglichen sie den Nachweis einer hohen Kernfraktionierung mit MALAT1, während eine zytoplasmatische Fraktionierung voraussichtlich gering ist. Umgekehrt wird bei Verwendung von TUG1 erwartet, dass die zytoplasmatischen Fraktionierungsniveaus höher sind als die Kernfraktionierungsniveaus.
Mit Hilfe dieses Protokolls war es möglich, RNAs basierend auf ihrer Wirkungsposition innerhalb der Zelle zu isolieren. Aufgrund des weit verbreiteten Zugangs zu vielen Materialien und der Verwendung von nur Lysepuffer- und dichtebasierten Zentrifugationstechniken während dieses Experiments ist die Anwendbarkeit auf andere RNA-Typen und andere zelluläre Komponenten weit verbreitet. Dies kann wichtige Informationen liefern, indem standortspezifische Ausdrucksereignisse beleuchtet werden, die sonst ohne Trennung nicht zu unterscheiden wären.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agilent Tapestation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991BA</td>
			<td>The Agilent TapeStation system is an automated electrophoresis solution for the sample quality control of DNA and RNA samples.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Nonidet P-40</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>28324</td>
			<td>Used in the making of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mM Tris-Cl pH 8.0</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>15568025</td>
			<td>Used in the making of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALAT1 GE Assay</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>Hs00273907_s1</td>
			<td>Utilized for confirmation of Nuclear fraction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>4326659</td>
			<td>The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>4311971</td>
			<td>The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate during qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012-023</td>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) is a balanced salt solution that is used for a variety of cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue samples, diluting cells for counting, and preparing reagents.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen RNA Clean Up Kit-Rneasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td>RNA cleanup kits enable efficient RNA cleanup of enzymatic reactions and cleanup of RNA purified by different methods. Includes RW1, RLT, RW1 buffers mentioned throughout protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>A43180</td>
			<td>qPCR software utilized during protocol. Includes Design and Analysis Software for analyzing fractionation samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RLT Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>Lysis Buffer from RNA clean-up kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPE Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1018013</td>
			<td>Wash Buffer from RNA clean-up kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RW1 Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1053394</td>
			<td>Wash Buffer from RNA clean-up kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman Gene Expression Assays</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays represent the largest collection of predesigned assays in the industry with over 2.8 million assays across 32 eukaryotic species and numerous microbes. TaqMan Gene Expression assays enable you to get results fast with no time wasted optimizing SYBR Green primers and no extra time spent running and analyzing melt curves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>4305719</td>
			<td>TaqMan Universal PCR Master Mix is the ideal reagent solution when you need a master mix for multiple 5&#39; nuclease DNA applications. Applied Biosystems reagents have been validated with TaqMan assays and Applied Biosystems real-time systems to ensure sensitive, accurate, and reliable performance every time.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUG1 GE Assay</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>Hs00215501_m1</td>
			<td>Utilized for confirmation of Cytoplasmic fraction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DEPC-Treated Water</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>750024</td>
			<td>UltraPure DEPC-treated Water is suitable for use with RNA. It is prepared by incubating with 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC), and is then autoclaved to remove the DEPC. Sterile filtered.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of cytoplasmic and nuclear long rnas from primary and cultured cells

Die Trennung intrazellulärer Komponenten ist seit vielen Jahren ein Schlüsselwerkzeug in der Zellbiologie und konnte nützliche Erkenntnisse darüber liefern, wie sich ihre Lage auf ihre Funktion auswirken kann. Insbesondere die Trennung von nukleärer und zytoplasmatischer RNA ist im Zusammenhang mit Krebszellen und der Suche nach neuen Angriffspunkten für Medikamente wichtig geworden. Der Kauf von Kits für die nukleär-zytoplasmatische RNA-Extraktion kann kostspielig sein, wenn viele der benötigten Materialien in einer typischen Laborumgebung gefunden werden können. Mit dem vorliegenden Verfahren, das teurere Kits oder andere zeitaufwändige Prozesse ersetzen kann, werden nur ein hausgemachter Lysepuffer, eine Tischzentrifuge und RNA-Isolationsreinigungssäulen benötigt, um nukleare und zytoplasmatische RNA zu isolieren. Lysepuffer wird verwendet, um die äußere Membran der Zelle sanft zu lysieren, ohne die Integrität der Kernhülle zu beeinträchtigen, wodurch ihre intrazellulären Komponenten freigesetzt werden können. Dann können die Kerne durch einen einfachen Zentrifugationsschritt isoliert werden, da sie eine höhere Dichte als die Lyselösung besitzen. Zentrifugation wird verwendet, um diese Bereiche basierend auf ihren Dichteunterschieden zu trennen, um subzelluläre Elemente im Zellkern von denen im Zytoplasma zu isolieren. Sobald die Zentrifugation die verschiedenen Komponenten isoliert hat, wird ein RNA-Clean-up-Kit verwendet, um den RNA-Gehalt zu reinigen, und es wird eine qPCR durchgeführt, um die Trennqualität zu validieren, die durch die Menge an nukleärer und zytoplasmatischer RNA in den verschiedenen Fraktionen quantifiziert wird. Es wurden statistisch signifikante Trennungsgrade erreicht, was die Wirksamkeit des Protokolls verdeutlicht. Darüber hinaus kann dieses System für die Isolierung verschiedener RNA-Typen (Gesamt-, Klein-RNA usw.) angepasst werden, was eine gezielte Untersuchung von Zytoplasma-Kern-Wechselwirkungen ermöglicht und zum Verständnis der Unterschiede in der Funktion von RNA beiträgt, die sich im Zellkern und im Zytoplasma befindet.

Um sicherzustellen, dass eine nukleare und zytoplasmatische Isolierung erreicht wurde, wurde eine qPCR durchgeführt, um die Ergebnisse zu validieren. Dabei wurden Primer verwendet, die für die interessierende Region spezifisch sind, um die nuklearen und zytoplasmatischen Fraktionierungsniveaus zu demonstrieren. In dieser Studie wurden MALAT1 und TUG1 als nukleäre bzw. zytoplasmatische Primer verwendet. Zusammen ermöglichen sie den Nachweis eines hohen Niveaus der Kernfraktionierung mit MALAT1 als Positivkontrolle fü...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Cytoplasmic and Nuclear Long RNAs from Primary and Cultured Cells at JoVE.com

Preparation of Cytoplasmic and Nuclear Long RNAs from Primary and Cultured Cells

Das vorliegende Protokoll bietet eine effiziente und flexible Methode, um RNA aus nukleären und zytoplasmatischen Fraktionen unter Verwendung kultivierter Zellen zu isolieren und dann mittels qPCR zu validieren. Dies dient effektiv als Ersatz für andere RNA-Präparationskits.

Herstellung von zytoplasmatischen und nukleären langen RNAs aus primären und kultivierten Zellen

The separation of intracellular components has been a key tool in cellular biology for many years now and has been able to provide useful insight into how ...

Dieses Protokoll ist notwendig, um die unterschiedlichen Rollen definierter biochemischer Elemente im Zellkern und im Zytoplasma zu bewerten und intrazelluläre Interaktionen zwischen diesen Domänen innerhalb verschiedener Zelllinien zu analysieren. Diese Technik verwendet alltägliche Laborgeräte und Reagenzien, um die zytoplasmatischen und nuklearen Fraktionen effizienter zu trennen. Dieses Protokoll kann dies kostengünstiger und schneller als andere Protokolle tun.Mit zunehmender Verbreitung von Studien zu zytoplasmatischen und nukleären Wechselwirkungen können die Auswirkungen der Lokalisierung auf intrazelluläre Ereignisse besser verstanden werden. Der Austausch zwischen dem Zytoplasma und dem Zellkern kann analysiert werden, was darauf hinweist, ob bestimmte Moleküle während dieses Austauschs zur Krebsentstehung führen können, wie Studien an Kernproteinen gezeigt haben. Der kritischste Schritt im Protokoll besteht darin, die Konzentration des Lysepuffers auf eine geeignete Konzentration zu ändern.Da die Verwendung von Lysepuffer weitgehend von der Störung der Zellmembranen abhängt, gibt es natürliche Varianten in der Wirksamkeit von Lysepuffer auf verschiedenen Zelllinien. Zu Beginn pelletieren Sie die Zellen mit 1,5-Milliliter-Röhrchen durch Zentrifugation für fünf Minuten bei 2000 G.Entsorgen Sie den Überstand mit einer Aspirationspipette. Resuspendieren Sie das Pellet in 300 Mikroliter eiskaltem Lysepuffer.Dann drehen Sie die Röhrchen zwei Minuten lang mit einer Geschwindigkeit von etwa 12.000 G bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und legen Sie ihn in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen. Das verbleibende Pellet ist die Kernfraktion.Als nächstes geben Sie 500 Mikroliter eiskaltes PBS in das Pellet und zentrifugieren Sie es bei 2000 G für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Um die Trennung der Kompartimente mittels qPCR zu bestätigen, wandeln Sie zunächst die RNA mit einem handelsüblichen Kit in komplementäre DNA um. Bereiten Sie den Reverse-Transkriptase-Mastermix vor.Fügen Sie Template-RNA hinzu. Inkubationsreaktionen in einem Thermocycler. Fahren Sie mit der Durchführung einer quantitativen Polymerase-Kettenreaktion und -analyse fort.Beginnen Sie mit der Verdünnung der cDNA-Synthese mit DEPC-Wasser, um eine Endkonzentration von 20 Nanogramm pro Milliliter zu erreichen. Bereiten Sie mit einem PCR-Mastermix die Reaktion für jede Probe anhand manueller Anweisungen vor. Erwerben Sie kommerzielle Sonden, die zum Nachweis der zytoplasmatischen und nuklearen Fraktionierung erforderlich sind.Verwenden Sie MALAT1 als Kernmarker und TUG1 als zytoplasmatischen Marker. Berechnen Sie das Volumen jeder Komponente, indem Sie jede Komponente für jedes der technischen Replikate für die einzelne Probe mit drei multiplizieren. Erfassen Sie für jede nukleare und zytoplasmatische Probe die Mischungen Kernfraktion mit MALAT1, zytoplasmatische Fraktion mit MALAT1, Kernfraktion mit TUG1 und zytoplasmatische Fraktion mit TUG1.Vortex, um Lösungen kurz zu mischen und 20 Mikroliter der Mischung in jede Vertiefung einer optischen Reaktionsplatte zu überführen. Decken Sie die Platte mit einer durchsichtigen Klebefolie ab, die für die qPCR verwendet wird, und zentrifugieren Sie die Platte kurz, um Luftblasen zu entfernen, und schleudern Sie die Probe dann fünf Minuten lang bei Raumtemperatur auf das 300-fache G. Wählen Sie mit einer Konstruktions- und Analysesoftware die Standardkurve für die Zyklusparameter aus.Wählen Sie mit der qPCR-Software Setup ausführen aus. Wählen Sie auf der Eigenschaftenseite der Datendatei die Parameter Methode und Eingabezyklus aus. Wählen Sie nach der Eingabe der Zyklusparameter die Registerkarte "Platte" aus und geben Sie die zu verarbeitenden Proben ein.Wählen Sie Ausführen starten. Erstellen Sie nach Abschluss des Laufs eine Datentabelle mit dem Probennamen, dem Zielnamen und dem Quantifizierungszyklus. Beginnen Sie mit den MALAT1-Proben, um den Kernanteil zu berechnen.Subtrahieren Sie die zytoplasmatische Fraktion MALAT1 von der Kernfraktion MALAT1. Fahren Sie mit den MALAT1-Proben fort, um den zytoplasmatischen Anteil zu berechnen. Subtrahieren Sie die MALAT1-Kernfraktion von der zytoplasmatischen MALAT1-Fraktion und berechnen Sie dann die beiden auf negative Delta-CQ angehobenen Fraktionen. Führen Sie die Berechnungen mit TUG1-Stichproben durch.Wenn TUG1 als Positivkontrolle für zytoplasmatische Elemente vorhanden ist, wird erwartet, dass die zytoplasmatischen Fraktionierungsniveaus höher sind als die Kernfraktionierungsniveaus. Ein negatives Ergebnis, bei dem in der Probe mit MALAT1 eine zytoplasmatische Fraktionierung beobachtet wird. Dies deutet auf eine Kontamination von RNA hin, die aus der Kernfraktion isoliert wurde, möglicherweise aufgrund zu niedriger oder zu hoher Lysekonzentrationen.MALAT1 und TUG1 zeigten die höchste Korrelation mit der nuklearen und zytoplasmatischen Trennung, was durch einen Western-Blot und eine RNA-Elektrophorese bestätigt wurde, die die Reinheit und Qualität der Proben bestätigte. Zusätzlich kann die Reinheit von nukleären und zytoplasmatischen Extrakten durch einen Western Blot unter Verwendung von Lamin als Marker für die Kernfraktion und Alpha-Tubulin als positivem Marker für die zytoplasmatische Fraktion nachgewiesen werden. In der zytoplasmatischen RNA-Elektrophorese wurde kein Peak beobachtet, was eine hohe Qualität und eine geringe oder keine Kontamination in der zytoplasmatischen RNA-Probe zeigt.Die Verwendung von Lysepuffer ist entscheidend für eine ordnungsgemäße Fraktionierung, und die Optimierung der Lysepufferkonzentration auf die gewünschte Zelllinie von Interesse ist unerlässlich. Diese Technik ermöglicht die gezielte Untersuchung der nukleären und zytoplasmatischen Wechselwirkung, die auf eine Vielzahl von Forschungsthemen anwendbar ist und ein besseres Verständnis dafür ermöglicht, wie die Lokalisierung bestimmter biologischer Elemente mit ihrer Funktion korrelieren kann.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood

Erfassung und Veröffentlichung durchführbare zirkulierender Tumorzellen aus Blut

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

Forschung

Krebsforschung

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Vorbereitung und metabolische Assay von 3-dimensionalen Sphäroid Ko-Kulturen von Pankreaskarzinom-Zellen und Fibroblasten

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

Entwicklung eines menschlichen präklinischen Modell der Osteoclastogenesis aus peripherem Blut Monozyten Co mit Brustkrebszelllinien kultiviert

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

Vorbereitung der primäre akute lymphoblastische Leukämie-Zellen in verschiedenen Zellzyklus Phasen durch zentrifugale Sammelnetzwerk

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

Charakterisierung von Tumorzellen mit einem medizinischen Draht zur Erfassung von zirkulierenden Tumorzellen: 3D Ansatz basierend auf Immunfluoreszenz und DNA-Fisch

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

An Orthotopic Endometrial Cancer Model with Retroperitoneal Lymphadenopathy Made From In Vivo Propagated and Cultured VX2 Cells

Ein orthotopisches Endometriumkrebs-Modell mit retroperitonealer Lymphadenopathie made From In Vivo Propagated and Cultured VX2 Cells

Endometrial cancer is the most common gynecologic malignancy in North America and the incidence is rising worldwide. Treatment consists of surgery with or ...

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Gewinnung von wässrigen Metaboliten aus kultivierten Adherenten Zellen für die metabolomische Analyse durch die kapitänische Spektrometrie Elektrophoresis-Mass

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

Subzelluläre Fraktionierung der primären chronischen lymphatischen Leukämiezellen zur Überwachung des nuklearen/zytoplasmatischen Proteinhandels

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Immunfluoreszenz Bildgebung von DNA-Schäden und Reparatur-Fozien in menschlichen Darmkrebszellen

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Measurement of the Compressibility of Cell and Nucleus Based on Acoustofluidic Microdevice

Messung der Kompressibilität von Zelle und Zellkern mittels akustofluidischem Mikrogerät

Cell mechanics play an important role in tumor metastasis, malignant transformation of cells, and radiosensitivity. During these processes, studying the ...