Name: preparation of cytoplasmic and nuclear long rnas from primary and cultured cells
Uploaded: 2023-04-07T13:20:00
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Sostenuto da sovvenzioni dell'American Society of Hematology, della Robert Wood Johnson Foundation, della Doris Duke Charitable Foundation, della Edward P. Evans Foundation e del National Cancer Institute (1K08CA230319).

Le cellule K562 sono utilizzate per il presente studio. Questo protocollo è stato ottimizzato per funzionare per 1 x 10 6-5 x 106 milioni di celle. Tuttavia, la procedura può essere scalata per quantità di celle maggiori aumentando i volumi in modo appropriato.
1. Preparazione del tampone di lisi 0,25x
<ol><li>Preparare un tampone di lisi 0,25x miscelando i seguenti componenti forniti nella Tabella 1A. NOTA: I campioni richiedono ...

<ol>
	<li>Conrad, T., Orom, U. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+fractionation+and+isolation+of+chromatin-associated+RNA.">Cellular fractionation and isolation of chromatin-associated RNA.</a> Methods in Molecular Biology. 1468, 1-9 (2017).</li><li>Bashirullah, A., Cooperstock, R. L., Lipshitz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+localization+in+development.">RNA localization in development.</a> Annual Review of Biochemistry. 67, 335-394 (1998).</li><li>Liu, X., Fagotto, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+separate+nuclear,+cytosolic,+and+membrane-associated+signaling+molecules+in+cultured+cells.">A method to separate nuclear, cytosolic, and membrane-associated signaling molecules in cultured cells.</a> Science Signaling. 4 (203), (2011).</li><li>Jansen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+localization:+message+on+the+move.">mRNA localization: message on the move.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (4), 247-256 (2001).</li><li>Carlevaro-Fita, J., Johnson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+positioning+system:+Understanding+long+noncoding+RNAs+through+subcellular+localization.">Global positioning system: Understanding long noncoding RNAs through subcellular localization.</a> Molecular Cell. 73 (5), 869-883 (2019).</li><li>Voit, E. O., Martens, H. A., Omholt, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=150+years+of+the+mass+action+law.">150 years of the mass action law.</a> PLOS Computational Biology. 11 (1), 1004012 (2015).</li><li>El-Tanani, M., Dakir el, H., Raynor, B., Morgan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+nuclear+export+in+cancer+and+resistance+to+chemotherapy.">Mechanisms of nuclear export in cancer and resistance to chemotherapy.</a> Cancers (Basel). 8 (3), 35 (2016).</li><li>Turner, J. G., Dawson, J., Sullivan, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+export+of+proteins+and+drug+resistance+in+cancer).">Nuclear export of proteins and drug resistance in cancer).</a> Biochemical Pharmacology. 83 (8), 1021-1032 (2012).</li><li>Boesenberg-Smith, K. A., Pessarakli, M. M., Wolk, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+DNA+yield+and+purity:+an+overlooked+detail+of+PCR+troubleshooting.">Assessment of DNA yield and purity: an overlooked detail of PCR troubleshooting.</a> Clinical Microbiology Newsletter. 34 (1), 1-6 (2012).</li><li>Taylor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+nuclear+export+signal+recognition+as+a+driver+of+oncogenesis+altered+nuclear+export+signal+recognition+drives+oncogenesis.">Altered nuclear export signal recognition as a driver of oncogenesis altered nuclear export signal recognition drives oncogenesis.</a> Cancer Discovery. 9 (10), 1452-1467 (2019).</li><li>Ayupe, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+biogenesis,+stability+and+sub-cellular+localization+of+lncRNAs+mapping+to+intragenic+regions+of+the+human+genome.">Global analysis of biogenesis, stability and sub-cellular localization of lncRNAs mapping to intragenic regions of the human genome.</a> RNA Biology. 12 (8), 877-892 (2015).</li><li>Ghuysen, J. -. M., Hakenbeck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacterial Cell Wall. , (1994).</li><li>Fersht, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Enzyme Structure and Mechanism. , (1985).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> How to win the battle with RNase. 2019 (2), (2019).</li><li>Blumberg, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+a+ribonuclease-free+environment.">Creating a ribonuclease-free environment.</a> Methods in Enzymology. 152, 20-24 (1987).</li><li>Abmayr, S. M., Yao, T., Parmely, T., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+nuclear+and+cytoplasmic+extracts+from+mammalian+cells.">Preparation of nuclear and cytoplasmic extracts from mammalian cells.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2006).</li><li>Taylor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selinexor,+a+first-in-class+XPO1+inhibitor,+is+efficacious+and+tolerable+in+patients+with+myelodysplastic+syndromes+refractory+to+hypomethylating+agents.">Selinexor, a first-in-class XPO1 inhibitor, is efficacious and tolerable in patients with myelodysplastic syndromes refractory to hypomethylating agents.</a> Blood. 132, 233 (2018).</li></ol>

Durante tutto il protocollo, sono stati presi alcuni passaggi per ottimizzare gli elementi per essere più efficaci per la linea cellulare di interesse. Mentre i passaggi all'interno del protocollo sono relativamente semplici, possono essere necessarie analisi e piccoli aggiustamenti durante gli aspetti critici del protocollo. Il passo più critico nel protocollo è modificare la concentrazione del tampone di lisi in una concentrazione appropriata basata sulla linea cellulare di interesse e sul bersaglio cellulare. Poich...

Il frazionamento cellulare in componenti subcellulari consente l'isolamento e lo studio di domini biochimici definiti e aiuta a determinare la localizzazione di specifici processi cellulari e come questo può influire sulla loro funzione1. L'isolamento dell'RNA da diverse posizioni intracellulari può consentire una migliore accuratezza dell'analisi genetica e biochimica degli eventi a livello di trascrizione e di altre interazioni tra il nucleo e il citoplasma, che funge da scopo primario dell'attuale protocollo2. Questo protocollo è stato sviluppato per garantire l'isolamento degli RNA citoplasmatici e nucleari per determinare i loro rispettivi ruoli nell'esportazione nucleare e per capire come la localizzazione subcellulare degli RNA nel nucleo e nel citoplasma possa influire sulla loro funzione nei processi cellulari. Utilizzando materiali provenienti da un tipico ambiente di laboratorio, è stato possibile ottenere il frazionamento nucleare e citoplasmatico in modo più efficace e meno costoso rispetto ai protocolli precedentemente stabiliti senza compromettere la qualità dei risultati3.
Inoltre, lo scambio di molecole tra il citoplasma e il nucleo può essere studiato direttamente separando queste regioni. Più specificamente, la comprensione del trascrittoma è essenziale per comprendere lo sviluppo e la malattia. Tuttavia, gli RNA possono essere a diversi livelli di maturazione in un dato momento e possono complicare l'analisi a valle. Questo protocollo consente la capacità di isolare l'RNA da frazioni subcellulari nucleari e citoplasmatiche, che possono aiutare negli studi dell'RNA e consentire una migliore comprensione di un particolare RNA di interesse, come la localizzazione di RNA non codificanti o l'analisi delle giunzioni di giunzione all'interno del nucleo.
Questo protocollo è stato ottimizzato per isolare RNA lunghi citoplasmatici e nucleari, inclusi mRNA, rRNA e RNA lunghi non codificanti (lncRNA), a causa della selettività dimensionale della colonna di purificazione dell'RNA utilizzata, che può essere modificata per isolare altri RNA di interesse. In precedenza, la funzione degli RNA lunghi, come mRNA e lncRNA, dipendeva fortemente dalla loro rispettiva localizzazione all'interno della cellula 4,5. Pertanto, lo studio dell'esportazione dal nucleo ai domini subcellulari è diventato più mirato verso la comprensione del ruolo che l'esportazione di RNA o altri componenti cellulari può avere sulla cellula. Gli lncRNA servono come primo esempio di questo, poiché la loro traduzione e i successivi effetti si basano in gran parte sulla vicinanza e sulle interazioni con altre forme di RNA6. Inoltre, lo scambio di elementi cellulari tra regioni nucleari e citoplasmatiche è legato a meccanismi di resistenza a vari trattamenti antitumorali7. L'isolamento dei compartimenti intracellulari ha permesso lo sviluppo di inibitori nucleari dell'esportazione, che ha ridotto gli effetti dei meccanismi di resistenza a diverse terapie8.
Dopo aver separato l'RNA nucleare e citoplasmatico, vengono eseguiti passaggi per purificare l'RNA di interesse. Poiché i kit di purificazione dell'RNA si trovano comunemente all'interno dei laboratori e funzionano per purificare e isolare gli RNA lunghi, servono bene allo scopo di questo protocollo. Per la purificazione dell'RNA, generare rapporti 260:280 superiori a 1,8 è fondamentale per garantire la qualità dei campioni per il sequenziamento dell'RNA o altre procedure simili che richiedono alti livelli di purezza e isolamento. Valori irregolari di 260:280 indicano contaminazione da fenolo, dimostrando uno scarso isolamento e producendo risultati imprecisi9.
Una volta completata la purificazione dell'RNA e confermati valori 260:280 al di sopra di un intervallo accettabile, la qPCR è stata utilizzata per convalidare i risultati di isolamento delle frazioni nucleari e citoplasmatiche. In tal modo, sono stati utilizzati primer specifici per la regione di interesse per dimostrare i livelli di frazionamento nucleare e citoplasmatico. In questo protocollo, MALAT1 e TUG1 sono stati utilizzati come marcatori nucleari e citoplasmatici, rispettivamente10. Insieme, consentono la dimostrazione di alti livelli di frazionamento nucleare con MALAT1, mentre il frazionamento citoplasmatico dovrebbe essere basso. Al contrario, quando viene utilizzato TUG1, i livelli di frazionamento citoplasmatico dovrebbero essere superiori ai livelli di frazionamento nucleare.
Utilizzando questo protocollo, è stato possibile isolare gli RNA in base alla loro posizione di azione all'interno della cellula. A causa dell'ampio accesso a molti materiali e dell'utilizzo del solo tampone di lisi e delle tecniche di centrifugazione basate sulla densità durante questo esperimento, l'applicabilità ad altri tipi di RNA e ad altri componenti cellulari è diffusa. Questo può fornire informazioni importanti facendo luce su eventi di espressione specifici della posizione che altrimenti sarebbero indistinguibili senza separazione.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agilent Tapestation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991BA</td>
			<td>The Agilent TapeStation system is an automated electrophoresis solution for the sample quality control of DNA and RNA samples.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Nonidet P-40</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>28324</td>
			<td>Used in the making of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mM Tris-Cl pH 8.0</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>15568025</td>
			<td>Used in the making of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALAT1 GE Assay</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>Hs00273907_s1</td>
			<td>Utilized for confirmation of Nuclear fraction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>4326659</td>
			<td>The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>4311971</td>
			<td>The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate during qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012-023</td>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) is a balanced salt solution that is used for a variety of cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue samples, diluting cells for counting, and preparing reagents.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen RNA Clean Up Kit-Rneasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td>RNA cleanup kits enable efficient RNA cleanup of enzymatic reactions and cleanup of RNA purified by different methods. Includes RW1, RLT, RW1 buffers mentioned throughout protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>A43180</td>
			<td>qPCR software utilized during protocol. Includes Design and Analysis Software for analyzing fractionation samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RLT Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>Lysis Buffer from RNA clean-up kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPE Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1018013</td>
			<td>Wash Buffer from RNA clean-up kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RW1 Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1053394</td>
			<td>Wash Buffer from RNA clean-up kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman Gene Expression Assays</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays represent the largest collection of predesigned assays in the industry with over 2.8 million assays across 32 eukaryotic species and numerous microbes. TaqMan Gene Expression assays enable you to get results fast with no time wasted optimizing SYBR Green primers and no extra time spent running and analyzing melt curves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>4305719</td>
			<td>TaqMan Universal PCR Master Mix is the ideal reagent solution when you need a master mix for multiple 5&#39; nuclease DNA applications. Applied Biosystems reagents have been validated with TaqMan assays and Applied Biosystems real-time systems to ensure sensitive, accurate, and reliable performance every time.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUG1 GE Assay</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>Hs00215501_m1</td>
			<td>Utilized for confirmation of Cytoplasmic fraction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DEPC-Treated Water</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>750024</td>
			<td>UltraPure DEPC-treated Water is suitable for use with RNA. It is prepared by incubating with 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC), and is then autoclaved to remove the DEPC. Sterile filtered.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of cytoplasmic and nuclear long rnas from primary and cultured cells

La separazione dei componenti intracellulari è stata uno strumento chiave nella biologia cellulare per molti anni ed è stata in grado di fornire informazioni utili su come la loro posizione può influire sulla loro funzione. In particolare, la separazione dell'RNA nucleare e citoplasmatico è diventata importante nel contesto delle cellule tumorali e nella ricerca di nuovi bersagli per i farmaci. L'acquisto di kit per l'estrazione dell'RNA nucleare-citoplasmatico può essere costoso quando molti dei materiali richiesti possono essere trovati all'interno di un tipico ambiente di laboratorio. Utilizzando il metodo attuale, che può sostituire kit più costosi o altri processi che richiedono tempo, sono necessari solo un tampone di lisi fatto in casa, una centrifuga da banco e colonne di purificazione dell'isolamento dell'RNA per isolare l'RNA nucleare e citoplasmatico. Il tampone di lisi viene utilizzato per lisare delicatamente la membrana esterna della cellula senza compromettere l'integrità dell'involucro nucleare, consentendo il rilascio dei suoi componenti intracellulari. Quindi, i nuclei possono essere isolati con una semplice fase di centrifugazione poiché possiedono una densità maggiore rispetto alla soluzione di lisi. La centrifugazione viene utilizzata per separare queste aree in base alle loro differenze di densità per isolare gli elementi subcellulari nel nucleo da quelli nel citoplasma. Una volta che la centrifugazione ha isolato i diversi componenti, viene utilizzato un kit di pulizia dell'RNA per purificare il contenuto di RNA e viene eseguita la qPCR per convalidare la qualità della separazione, quantificata dalla quantità di RNA nucleare e citoplasmatico nelle diverse frazioni. Sono stati raggiunti livelli di separazione statisticamente significativi, che illustrano l'efficacia del protocollo. Inoltre, questo sistema può essere adattato per l'isolamento di diversi tipi di RNA (RNA totale, piccolo, ecc.), Il che consente uno studio mirato delle interazioni citoplasma-nucleo e aiuta a comprendere le differenze nella funzione dell'RNA che risiedono nel nucleo e nel citoplasma.

Per garantire che l'isolamento nucleare e citoplasmatico fosse stato raggiunto, è stata eseguita una qPCR per convalidare i risultati. In tal modo, sono stati utilizzati primer specifici per la regione di interesse per dimostrare i livelli di frazionamento nucleare e citoplasmatico. In questo studio, MALAT1 e TUG1 sono stati utilizzati rispettivamente come primer nucleari e citoplasmatici. Insieme, consentono la dimostrazione di alti livelli di frazionamento nucleare con MALAT1 come controllo positivo per gli elementi n...

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Preparation of Cytoplasmic and Nuclear Long RNAs from Primary and Cultured Cells

Il presente protocollo offre un metodo efficiente e flessibile per isolare l'RNA da frazioni nucleari e citoplasmatiche utilizzando cellule in coltura e quindi convalidare utilizzando qPCR. Questo serve efficacemente come sostituto per altri kit di preparazione dell'RNA.

Preparazione di RNA lunghi citoplasmatici e nucleari da cellule primarie e in coltura

The separation of intracellular components has been a key tool in cellular biology for many years now and has been able to provide useful insight into how ...

Questo protocollo è necessario per valutare i diversi ruoli di elementi biochimici definiti nel nucleo e nel citoplasma e per analizzare le interazioni intracellulari tra questi domini all'interno di varie linee cellulari. Questa tecnica utilizza apparecchiature di laboratorio e reagenti comuni per separare in modo più efficiente le frazioni citoplasmatiche e nucleari. Questo protocollo può farlo in modo meno costoso e più veloce rispetto ad altri protocolli.Man mano che gli studi sulle interazioni citoplasmatiche e nucleari diventano più diffusi, l'impatto della localizzazione sugli eventi intracellulari può essere meglio compreso. Lo scambio tra il citoplasma e il nucleo può essere analizzato, indicando se alcune molecole durante questi scambi possono portare allo sviluppo del cancro, come hanno indicato studi sulle proteine nucleari. Il passo più critico nel protocollo è modificare la concentrazione del tampone di lisi a una concentrazione adeguata.Poiché l'uso del tampone di lisi dipende in gran parte dalla rottura delle membrane cellulari e ci sono varianti naturali nell'efficacia del tampone di lisi su diverse linee cellulari. Per iniziare, pellettare le celle, utilizzando tubi da 1,5 millilitri tramite centrifugazione per cinque minuti a 2000 G.Scartare il surnatante usando una pipetta aspirante. Risospendere il pellet in 300 microlitri di tampone di lisi ghiacciato.Quindi, ruotare i tubi ad una velocità di circa 12.000 G a quattro gradi Celsius per due minuti. Rimuovere con attenzione il surnatante e posizionarlo in un nuovo tubo da 1,5 millilitri. Il pellet rimanente sarà la frazione nucleare.Quindi, aggiungere 500 microlitri di PBS ghiacciato al pellet e centrifugare a 2000 G per cinque minuti a temperatura ambiente. Per confermare la separazione dei compartimenti usando qPCR, in primo luogo, convertire l'RNA in DNA complementare utilizzando un kit disponibile in commercio. Preparare la master mix di trascrittasi inversa.Aggiungi modello di RNA. Incubare le reazioni in un termociclatore. Procedere per l'esecuzione della reazione a catena quantitativa della polimerasi e dell'analisi.Inizia diluendo la sintesi del cDNA con acqua DEPC per avere una concentrazione finale di 20 nanogrammi per millilitro. Utilizzando una miscela master PCR, preparare la reazione per ciascun campione utilizzando istruzioni manuali. Acquisire sonde commerciali necessarie per rilevare il frazionamento citoplasmatico e nucleare.Utilizzare MALAT1 come marcatore nucleare e TUG1 come marcatore citoplasmatico. Calcolare il volume di ciascun componente moltiplicando ogni componente per tre per ciascuna delle repliche tecniche per il singolo campione. Per ogni campione nucleare e citoplasmatico, acquisire la frazione nucleare miscelata con MALAT1, la frazione citoplasmatica con MALAT1, la frazione nucleare con TUG1 e la frazione citoplasmatica con TUG1.Vortice brevemente per mescolare le soluzioni e trasferire 20 microlitri della miscela in ciascun pozzetto di una piastra di reazione ottica. Coprire la piastra con una pellicola adesiva trasparente utilizzata per la qPCR e centrifugare brevemente la piastra per eliminare le bolle d'aria, quindi ruotare il campione a 300 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente. Utilizzando un software di progettazione e analisi, selezionare la curva standard per i parametri ciclici.Utilizzando il software qPCR, selezionare l'esecuzione del programma di installazione. Nella pagina delle proprietà del file di dati selezionare i parametri del metodo e del ciclo di input. Dopo aver inserito i parametri del ciclo, selezionare la scheda della piastra e immettere i campioni da eseguire.Seleziona avvia esecuzione. Al termine dell'esecuzione, creare un foglio di calcolo dei dati con il nome dell'esempio, il nome della destinazione e il ciclo di quantificazione. Inizia con i campioni MALAT1 per calcolare la frazione nucleare.Sottrarre la frazione citoplasmatica MALAT1 dalla frazione nucleare MALAT1. Continuare con i campioni MALAT1 per calcolare la frazione citoplasmatica. Sottrarre la frazione nucleare MALAT1 dalla frazione citoplasmatica MALAT1 e quindi calcolare i due elevati a delta CQ negativo. Eseguire i calcoli con campioni TUG1.Quando TUG1 è presente come controllo positivo per gli elementi citoplasmatici, i livelli di frazionamento citoplasmatico dovrebbero essere superiori ai livelli di frazionamento nucleare. Un risultato negativo quando si osservano livelli di frazionamento citoplasmatico nel campione con MALAT1. Ciò indica la contaminazione dell'RNA isolato dalla frazione nucleare, potenzialmente dovuta a concentrazioni di lisi troppo basse o troppo alte.MALAT1 e TUG1 hanno mostrato la più alta correlazione con la separazione nucleare e citoplasmatica, come confermato attraverso un Western blot e l'elettroforesi dell'RNA, che ha confermato la purezza e la qualità dei campioni. Inoltre, la purezza degli estratti nucleari e citoplasmatici può essere dimostrata da un Western blot che utilizza la lamina come marker per la frazione nucleare e l'alfa-tubulina come marker positivo per la frazione citoplasmatica. Nessun picco è stato osservato nell'elettroforesi dell'RNA citoplasmatico, dimostrando alta qualità e poca o nessuna contaminazione nel campione di RNA citoplasmatico.L'utilizzo del tampone di lisi è fondamentale per il corretto frazionamento e l'ottimizzazione della concentrazione del tampone di lisi alla linea cellulare di interesse desiderata è essenziale. Questa tecnica consente lo studio mirato dell'interazione nucleare e citoplasmatica, che è ampiamente applicabile a una varietà di argomenti di ricerca e consente una migliore comprensione di come la localizzazione di specifici elementi biologici può essere correlata alla loro funzione.

preparation-cytoplasmic-nuclear-long-rnas-from-primary-cultured

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated cancer associated fibroblasts are a key component of the tumor stroma that interact with cancer cells and support their growth and survival. Models that recapitulate the interaction of cancer cells and activated fibroblasts are important tools for studying the stromal biology and for development of antitumor agents. Here, a method is described for the rapid generation of robust 3-dimensional (3D) spheroid co-culture of pancreatic cancer cells and activated pancreatic fibroblasts that can be used for subsequent biological studies. Additionally, described is the use of 3D spheroids in carrying out functional metabolic assays to probe cellular bioenergetics pathways using an extracellular flux analyzer paired with a spheroid microplate. Pancreatic cancer cells (Patu8902) and activated pancreatic fibroblast cells (PS1) were co-cultured and magnetized using a biocompatible nanoparticle assembly. Magnetized cells were rapidly bioprinted using magnetic drives in a 96 well format, in growth media to generate spheroids with a diameter ranging between 400-600 &#181;m within 5-7 days of culture. Functional metabolic assays using Patu8902-PS1 spheroids were then carried out using the extracellular flux technology to probe cellular energetic pathways. The method herein is simple, allows consistent generation of cancer cell-fibroblast spheroid co-cultures and can be potentially adapted to other cancer cell types upon optimization of the current described methodology.

Here, a method is described for the preparation of 3-dimensional (3D) spheroid co-culture of pancreatic cancer cells and fibroblasts, followed by measurement of metabolic functions using an extracellular flux analyzer.

Preparazione e dosaggio metabolica della sferoide 3-dimensionale co-colture di cellule di cancro del pancreas e dei fibroblasti

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum deprivation; chemicals which arrest cells at different cell cycle phases; or the use of mitotic shake-off which exploits their reduced adherence. However, all of these have disadvantages. For example, serum starvation works well for normal cells but less well for tumor cells with compromised cell cycle checkpoints due to oncogene activation or tumor suppressor loss. Similarly, chemically-treated cell populations can harbor drug-induced damage and show stress-related alterations. A technique which circumvents these problems is counterflow centrifugal elutriation (CCE), where cells are subjected to two opposing forces, centrifugal force and fluid velocity, which results in the separation of cells on the basis of size and density. Since cells advancing through the cycle typically enlarge, CCE can be used to separate cells into different cell cycle phases. Here we apply this technique to primary acute lymphoblastic leukemia cells. Under optimal conditions, an essentially pure population of cells in G1 phase and a highly enriched population of cells in G2/M phases can be obtained in excellent yield. These cell populations are ideally suited for studying cell cycle-dependent mechanisms of action of anticancer drugs and for other applications. We also show how modifications to the standard procedure can result in suboptimal performance and discuss the limitations of the technique. The detailed methodology presented should facilitate application and exploration of the technique to other types of cells.

This protocol describes the use of centrifugal elutriation to separate primary acute lymphoblastic leukemia cells into different cell cycle phases.

Preparazione delle cellule di leucemia linfoblastica acuta primaria nel ciclo cellulare diverse fasi di classificazione mediante veicolo fluido centrifuga

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a better understanding of tumor heterogeneity and thus facilitate the selection of patients for personalized treatment. However, this is hampered because of the rarity of CTCs. We present an innovative approach for sampling a high volume of the patient blood and obtaining information about presence, phenotype, and gene translocation of CTCs. The method combines immunofluorescence staining and DNA fluorescent-in-situ-hybridization (DNA FISH) and is based on a functionalized medical wire. This wire is an innovative device that permits the in vivo isolation of CTCs from a large volume of peripheral blood. The blood volume screened by a 30-min administration of the wire is approximately 1.5-3 L. To demonstrate the feasibility of this approach, epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) expression and the chromosomal translocation of the ALK gene were determined in non-small-cell lung cancer (NSCLC) cell lines captured by the functionalized wire and stained with an immuno-DNA FISH approach. Our main challenge was to perform the assay on a 3D structure, the functionalized wire, and to determine immuno-phenotype and FISH signals on this support using a conventional fluorescence microscope. The results obtained indicate that catching CTCs and analyzing their phenotype and chromosomal rearrangement could potentially represent a new companion diagnostic approach and provide an innovative strategy for improving personalized cancer treatments.

We present a new approach to characterize tumor cells. We combined immunofluorescence with DNA fluorescent-in-situ-hybridization to evaluate cells captured by a functionalized medical wire capable of in vivo enriching CTCs directly from patient blood.

Caratterizzazione delle cellule del tumore usando un filo medico per l'acquisizione di cellule tumorali circolanti: un approccio 3D basato sul DNA pesce e immunofluorescenza

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

An Orthotopic Endometrial Cancer Model with Retroperitoneal Lymphadenopathy Made From In Vivo Propagated and Cultured VX2 Cells

Endometrial cancer is the most common gynecologic malignancy in North America and the incidence is rising worldwide. Treatment consists of surgery with or without adjuvant therapy depending on lymph node involvement as determined by lymphadenectomy. Lymphadenectomy is a morbid procedure, which has not been shown to have a therapeutic benefit in many patients, and thus a new method to diagnose lymph node metastases is required. To test novel imaging agents, a reliable model of endometrial cancer with retroperitoneal lymph node metastases is needed. The VX2 endometrial cancer model has been described frequently in the literature; however, significant variation exists with respect to the method of model establishment. Furthermore, no studies have reported on the use of cultured VX2 cells to create this model as only cells propagated in vivo have been previously used. Herein, we present a standardized surgical method and post-operative monitoring method for the establishment of the VX2 endometrial cancer model and report on the first use of cultured VX2 cells to create this model.

This protocol presents a standardized method to grow VX2 cells in culture and to create an orthotopic VX2 model of endometrial cancer with retroperitoneal lymph node metastases in rabbits. Orthotopic endometrial cancer models are important for the pre-clinical study of novel imaging modalities for the diagnosis of lymph node metastases.

Un modello di cancro endometriale ortotopico con retroperitoneale Lmphadenopatia fatta da cellule VX2 in vivo propagate e coltivate

Endometrial cancer is the most common gynecologic malignancy in North America and the incidence is rising worldwide. Treatment consists of surgery with or ...

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but also to identify biomarkers for early-stage cancer detection and prediction of chemotherapy response in cancer patients. Preparation of uniform samples for metabolomic analysis is a critical issue that remains to be addressed. Here, we present an easy and reliable protocol for extracting aqueous metabolites from cultured adherent cells for metabolomic analysis using capillary electrophoresis-mass spectrometry (CE-MS). Aqueous metabolites from cultured cells are analyzed by culturing and washing cells, treating cells with methanol, extracting metabolites, and removing proteins and macromolecules with spin columns for CE-MS analysis. Representative results using lung cancer cell lines treated with diamide, an oxidative reagent, illustrate the clearly observable metabolic shift of cells under oxidative stress. This article would be especially valuable to students and investigators involved in metabolomics research, who are new to harvesting metabolites from cell lines for analysis by CE-MS.

The purpose of this article is to describe a protocol for extraction of aqueous metabolites from cultured adherent cells for metabolomic analysis, particularly, capillary electrophoresis-mass spectrometry.

Estrazione di metaboliti acquosi da cellule aderenti coltivate per l'analisi metabolomica mediante elettroforesi capillare-spettrometria di massa

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant cellular localization disrupting their mechanism of action. The survival of chronic lymphocytic leukaemia (CLL) cells, among other cancer cells, is assisted by the deregulation of nuclear to cytoplasmic shuttling, at least in part through deregulation of the transport receptor XPO1 and the constitutive activation of PI3K-mediated signaling pathways. It is essential to understand the role of individual proteins in the context of their intracellular location to gain a deeper understanding of the role of such proteins in the pathobiology of the disease. Furthermore, identifying processes that underlie cell stimulation and the mechanism of action of specific pharmacological inhibitors, in the context of subcellular protein trafficking, will provide a more comprehensive understanding of the mechanism of action. The protocol described here enables the optimization and subsequent efficient generation of nuclear and cytoplasmic fractions from primary chronic lymphocytic leukemia cells. These fractions can be used to determine changes in protein trafficking between the nuclear and cytoplasmic fractions upon cell stimulation and drug treatment. The data can be quantified and presented in parallel with immunofluorescent images, thus providing robust and quantifiable data.

This protocol enables the optimization and subsequent efficient generation of nuclear and cytoplasmic fractions from primary chronic lymphocytic leukemia cells. These samples are used to determine protein localization as well as changes in protein trafficking that take place between the nuclear and cytoplasmic compartments upon cell stimulation and drug treatment.

Frazione subcellulare delle cellule linfonetiche croniche primarie per monitorare il traffico di proteine nucleari/citoplasmiche

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage response induced by neutron-gamma mixed-beam used in boron neutron capture therapy (BNCT). Specifically, the proposed methodology is applied for the detection of repair proteins activation which can be visualized as foci using antibodies specific to DNA double-strand breaks (DNA-DSBs). DNA repair foci were assessed by immunofluorescence in colon cancer cells (HCT-116) after irradiation with the neutron-mixed beam. DNA-DSBs are the most genotoxic lesions and are repaired in mammalian cells by two major pathways: non-homologous end-joining pathway (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR). The frequencies of foci, immunochemically stained, for commonly used markers in radiobiology like &#947;-H2AX, 53BP1 are associated with DNA-DSB number and are considered as efficient and sensitive markers for monitoring the induction and repair of DNA-DSBs. It was established that &#947;-H2AX foci attract repair proteins, leading to a higher concentration of repair factors near a DSB. To monitor DNA damage at the cellular level, immunofluorescence analysis for the presence of DNA-PKcs representative repair protein foci from the NHEJ pathway and Rad52 from the HRR pathway was planned. We have developed and introduced a reliable immunofluorescence staining protocol for the detection of radiation-induced DNA damage response with antibodies specific for repair factors from NHEJ and HRR pathways and observed radiation-induced foci (RIF). The proposed methodology can be used for investigating repair protein that is highly activated in the case of neutron-mixed beam radiation, thereby indicating the dominance of the repair pathway.

Radiation-induced DNA damage response activated by neutron mixed-beam used in boron neutron capture therapy (BNCT) has not been fully established. This protocol provides a step-by-step procedure to detect radiation-induced foci (RIF) of repair proteins by immunofluorescence staining in human colon cancer cell lines after irradiation with the neutron-mixed beam.

Immunofluorescenza Immagini di danno al DNA e riparazione Foci nelle cellule tumorali del colon umano

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Measurement of the Compressibility of Cell and Nucleus Based on Acoustofluidic Microdevice

Cell mechanics play an important role in tumor metastasis, malignant transformation of cells, and radiosensitivity. During these processes, studying the mechanical properties of the cells is often challenging. Conventional measurement methods based on contact such as compression or stretching are prone to cause cell damage, affecting measurement accuracy and subsequent cell culture. Measurements in adherent state can also affect accuracy, especially after irradiation since ionizing radiation will flatten cells and enhance adhesion. Here, a cell mechanics measurement system based on acoustofluidic method has been developed. The cell compressibility can be obtained by recording the cell motion trajectory under the action of the acoustic force, which can realize fast and non-destructive measurement in suspended state. This paper reports in detail the protocols for chip design, sample preparation, trajectory recording, parameter extraction and analysis. The compressibility of different types of tumor cells was measured based on this method. Measurement of the compressibility of nucleus was also achieved by adjusting the resonance frequency of the piezoelectric ceramic and the width of the microchannel. Combined with the molecular level verification of immunofluorescence experiments, the cell compressibility before and after drug-induced epithelial to mesenchymal transition (EMT) were compared. Further, the change of cell compressibility after X-ray irradiation with different doses was revealed. The cell mechanics measurement method proposed in this paper is universal and flexible and has broad application prospects in scientific research and clinical practice.

Here a protocol is presented to build a fast and non-destructive system for measuring cell or nucleus compressibility based on acoustofluidic microdevice. Changes in mechanical properties of tumor cells after epithelial-mesenchymal transition or ionizing radiation were investigated, demonstrating the application prospect of this method in scientific research and clinical practice.

Misura della comprimibilità di cellula e nucleo basata su microdispositivo acustofluidico

Cell mechanics play an important role in tumor metastasis, malignant transformation of cells, and radiosensitivity. During these processes, studying the ...

Organoidi tumorali e fibroblasti derivati dal cancro del pancreas da tessuto fresco

Establishment of Pancreatic Cancer-Derived Tumor Organoids and Fibroblasts From Fresh Tissue

Tumor organoids are three-dimensional (3D) ex vivo tumor models that recapitulate the biological key features of the original primary tumor tissues. Patient-derived tumor organoids have been used in translational cancer research and can be applied to assess treatment sensitivity and resistance, cell-cell interactions, and tumor cell interactions with the tumor microenvironment. Tumor organoids are complex culture systems that require advanced cell culture techniques and culture media with specific growth factor cocktails and a biological basement membrane that mimics the extracellular environment. The ability to establish primary tumor cultures highly depends on the tissue of origin, the cellularity, and the clinical features of the tumor, such as the tumor grade. Furthermore, tissue sample collection, material quality and quantity, as well as correct biobanking and storage are crucial elements of this procedure. The technical capabilities of the laboratory are also crucial factors to consider. Here, we report a validated SOP/protocol that is technically and economically feasible for the culture of ex vivo tumor organoids from fresh tissue samples of pancreatic adenocarcinoma origin, either from fresh primary resected patient donor tissue or patient-derived xenografts (PDX). The technique described herein can be performed in laboratories with basic tissue culture and mouse facilities and is tailored for wide application in the translational oncology field.

Autore in primo piano: Istituzione di organoidi tumorali e fibroblasti derivati dal cancro del pancreas da tessuto fresco  

Tumor organoids have revolutionized cancer research and the approach to personalized medicine. They represent a clinically relevant tumor model that allows researchers to stay one step ahead of the tumor in the clinic. This protocol establishes tumor organoids from fresh pancreatic tumor tissue samples and patient-derived xenografts of pancreatic adenocarcinoma origin.

Costituzione di organoidi e fibroblasti tumorali derivati dal cancro del pancreas da tessuto fresco

Tumor organoids are three-dimensional (3D) ex vivo tumor models that recapitulate the biological key features of the original primary tumor tissues. ...