Name: preparation of cytoplasmic and nuclear long rnas from primary and cultured cells
Uploaded: 2023-04-07T13:20:00
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미국 혈액 학회, 로버트 우드 존슨 재단, 도리스 듀크 자선 재단, 에드워드 P. 에반스 재단 및 국립 암 연구소 (1K08CA230319)의 보조금 지원.

K562 세포는 본 연구에 사용된다. 이 프로토콜은 1 x 106-5 x 10600 만 셀에 대해 작동하도록 최적화되었습니다. 그러나 볼륨을 적절하게 늘려 더 큰 셀 수량에 맞게 절차를 확장할 수 있습니다.
1. 0.25x 용해 완충액의 제조
<ol><li>표 1A에 제공된 다음 성분을 혼합하여 0.25x 용해 완충액을 준비합니다. 참고: 샘플에는 약 300μL의 0.25x 용해 완?...

<ol>
	<li>Conrad, T., Orom, U. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+fractionation+and+isolation+of+chromatin-associated+RNA.">Cellular fractionation and isolation of chromatin-associated RNA.</a> Methods in Molecular Biology. 1468, 1-9 (2017).</li><li>Bashirullah, A., Cooperstock, R. L., Lipshitz, H. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+localization:+message+on+the+move.">mRNA localization: message on the move.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (4), 247-256 (2001).</li><li>Carlevaro-Fita, J., Johnson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+positioning+system:+Understanding+long+noncoding+RNAs+through+subcellular+localization.">Global positioning system: Understanding long noncoding RNAs through subcellular localization.</a> Molecular Cell. 73 (5), 869-883 (2019).</li><li>Voit, E. O., Martens, H. A., Omholt, S. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+DNA+yield+and+purity:+an+overlooked+detail+of+PCR+troubleshooting.">Assessment of DNA yield and purity: an overlooked detail of PCR troubleshooting.</a> Clinical Microbiology Newsletter. 34 (1), 1-6 (2012).</li><li>Taylor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+nuclear+export+signal+recognition+as+a+driver+of+oncogenesis+altered+nuclear+export+signal+recognition+drives+oncogenesis.">Altered nuclear export signal recognition as a driver of oncogenesis altered nuclear export signal recognition drives oncogenesis.</a> Cancer Discovery. 9 (10), 1452-1467 (2019).</li><li>Ayupe, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+biogenesis,+stability+and+sub-cellular+localization+of+lncRNAs+mapping+to+intragenic+regions+of+the+human+genome.">Global analysis of biogenesis, stability and sub-cellular localization of lncRNAs mapping to intragenic regions of the human genome.</a> RNA Biology. 12 (8), 877-892 (2015).</li><li>Ghuysen, J. -. M., Hakenbeck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacterial Cell Wall. , (1994).</li><li>Fersht, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Enzyme Structure and Mechanism. , (1985).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> How to win the battle with RNase. 2019 (2), (2019).</li><li>Blumberg, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+a+ribonuclease-free+environment.">Creating a ribonuclease-free environment.</a> Methods in Enzymology. 152, 20-24 (1987).</li><li>Abmayr, S. M., Yao, T., Parmely, T., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+nuclear+and+cytoplasmic+extracts+from+mammalian+cells.">Preparation of nuclear and cytoplasmic extracts from mammalian cells.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2006).</li><li>Taylor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selinexor,+a+first-in-class+XPO1+inhibitor,+is+efficacious+and+tolerable+in+patients+with+myelodysplastic+syndromes+refractory+to+hypomethylating+agents.">Selinexor, a first-in-class XPO1 inhibitor, is efficacious and tolerable in patients with myelodysplastic syndromes refractory to hypomethylating agents.</a> Blood. 132, 233 (2018).</li></ol>

프로토콜 전반에 걸쳐, 관심 있는 세포주에 가장 효과적이도록 요소를 최적화하기 위한 몇 가지 단계가 취해졌다. 프로토콜 내의 단계는 비교적 간단하지만 프로토콜의 중요한 측면에서 분석 및 사소한 조정이 필요할 수 있습니다. 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 용해 완충액의 농도를 관심 세포주와 세포 표적에 따라 적절한 농도로 수정하는 것입니다. 용해 완충액의 이용은 세포막의 파괴에 ...

세포 내 구성 요소로의 세포 분획은 정의된 생화학적 영역의 분리 및 연구를 가능하게 하고 특정 세포 과정의 국소화와 이것이 기능에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 결정하는 데 도움이 됩니다1. 상이한 세포내 위치로부터 RNA를 분리하면 전사 수준 사건 및 핵과 세포질 사이의 다른 상호작용에 대한 유전적 및 생화학적 분석의 정확성이 향상될 수 있으며, 이는 현재 프로토콜2의 주요 목적이다. 이 프로토콜은 세포질 및 핵 RNA의 분리를 보장하여 핵 수출에서 각각의 역할을 결정하고 핵 및 세포질에서 RNA의 세포 내 국소화가 세포 과정에서의 기능에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 이해하기 위해 개발되었습니다. 일반적인 실험실 환경의 재료를 사용하여 결과의 품질을 위태롭게 하지 않으면서 이전에 확립된 프로토콜보다 더 효과적이고 저렴하게 핵 및 세포질 분획을 달성할 수 있었습니다3.
또한 세포질과 핵 사이의 분자 교환은 이러한 영역을 분리하여 직접 연구할 수 있습니다. 보다 구체적으로, 전사체를 이해하는 것은 발달과 질병을 이해하는 데 필수적입니다. 그러나 RNA는 주어진 시간에 다른 성숙 수준에 있을 수 있으며 다운스트림 분석을 복잡하게 만들 수 있습니다. 이 프로토콜은 핵 및 세포질 세포 내 분획에서 RNA를 분리하는 기능을 허용하여 RNA 연구에 도움이 될 수 있으며 비암호화 RNA의 국소화 또는 핵 내 스플라이스 접합부 분석과 같은 관심 있는 특정 RNA에 대한 더 나은 이해를 가능하게 합니다.
이 프로토콜은 mRNA, rRNA 및 긴 비암호화 RNA(lncRNA)를 포함한 세포질 및 핵 긴 RNA를 분리하는 데 최적화되어 있으며, 이는 관심 있는 다른 RNA를 분리하도록 변형될 수 있는 활용된 RNA 정제 컬럼의 크기 선택성으로 인해 사용됩니다. 이전에는 mRNA 및 lncRNA와 같은 긴 RNA의 기능이 세포 내 각각의 국소화에 크게 의존했습니다 4,5. 따라서 핵에서 세포 내 영역으로의 수출에 대한 연구는 RNA 또는 기타 세포 구성 요소를 수출하는 것이 세포에서 가질 수 있는 역할을 이해하는 데 더 중점을 두게 되었습니다. lncRNA는 번역 및 후속 효과가 다른 형태의 RNA6과의 근접성 및 상호 작용에 크게 의존하기 때문에 이에 대한 대표적인 예입니다. 또한, 핵 영역과 세포질 영역 사이의 세포 요소 교환은 다양한 암 치료에 대한 내성 메커니즘과 관련이 있다7. 세포 내 구획의 분리는 핵 수출 억제제의 개발을 허용했으며, 이는 다른 치료법에 대한 내성 메커니즘의 효과를 감소시켰다8.
핵 및 세포질 RNA를 분리한 후 관심 RNA를 정제하는 단계를 수행합니다. RNA 정제 키트는 실험실에서 흔히 볼 수 있으며 긴 RNA를 정제하고 분리하는 기능을 하기 때문에 이 프로토콜의 목적에 잘 부합합니다. RNA 정제의 경우, 1.8보다 큰 260:280 비율을 생성하는 것은 RNA 염기서열 분석 또는 높은 수준의 순도와 분리가 필요한 기타 유사한 절차를 위한 샘플의 품질을 보장하는 데 매우 중요합니다. 불규칙한 260:280 값은 페놀 오염을 나타내며, 분리가 불량하고 부정확한 결과를 산출합니다9.
RNA 정제가 완료되고 260:280 값이 허용 범위 이상인 것으로 확인되면 qPCR을 사용하여 핵 및 세포질 분획의 분리 결과를 검증했습니다. 그렇게 함으로써, 관심 영역에 특이적인 프라이머를 사용하여 핵 및 세포질 분획 수준을 입증했습니다. 이 프로토콜에서, MALAT1 및 TUG1은 각각 핵 및 세포질 마커로서 사용되었다10. 함께, 그들은 MALAT1을 사용하여 높은 수준의 핵 분획을 입증할 수 있는 반면, 세포질 분획은 낮을 것으로 예상됩니다. 반대로, TUG1이 사용되는 경우, 세포질 분획 수준은 핵 분획 수준보다 높을 것으로 예상된다.
이 프로토콜을 사용하여 세포 내 작용 위치에 따라 RNA를 분리할 수 있었습니다. 이 실험 동안 많은 물질에 대한 광범위한 접근과 용해 완충액 및 밀도 기반 원심분리 기술의 활용으로 인해 다른 RNA 유형 및 기타 세포 구성 요소에 대한 적용 가능성이 널리 퍼져 있습니다. 이는 분리 없이는 구별할 수 없는 위치별 표현 이벤트를 조명하여 중요한 정보를 제공할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agilent Tapestation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991BA</td>
			<td>The Agilent TapeStation system is an automated electrophoresis solution for the sample quality control of DNA and RNA samples.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Nonidet P-40</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>28324</td>
			<td>Used in the making of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mM Tris-Cl pH 8.0</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>15568025</td>
			<td>Used in the making of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALAT1 GE Assay</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>Hs00273907_s1</td>
			<td>Utilized for confirmation of Nuclear fraction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>4326659</td>
			<td>The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>4311971</td>
			<td>The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate during qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012-023</td>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) is a balanced salt solution that is used for a variety of cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue samples, diluting cells for counting, and preparing reagents.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen RNA Clean Up Kit-Rneasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td>RNA cleanup kits enable efficient RNA cleanup of enzymatic reactions and cleanup of RNA purified by different methods. Includes RW1, RLT, RW1 buffers mentioned throughout protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>A43180</td>
			<td>qPCR software utilized during protocol. Includes Design and Analysis Software for analyzing fractionation samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RLT Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>Lysis Buffer from RNA clean-up kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPE Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1018013</td>
			<td>Wash Buffer from RNA clean-up kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RW1 Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1053394</td>
			<td>Wash Buffer from RNA clean-up kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman Gene Expression Assays</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays represent the largest collection of predesigned assays in the industry with over 2.8 million assays across 32 eukaryotic species and numerous microbes. TaqMan Gene Expression assays enable you to get results fast with no time wasted optimizing SYBR Green primers and no extra time spent running and analyzing melt curves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>4305719</td>
			<td>TaqMan Universal PCR Master Mix is the ideal reagent solution when you need a master mix for multiple 5&#39; nuclease DNA applications. Applied Biosystems reagents have been validated with TaqMan assays and Applied Biosystems real-time systems to ensure sensitive, accurate, and reliable performance every time.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUG1 GE Assay</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>Hs00215501_m1</td>
			<td>Utilized for confirmation of Cytoplasmic fraction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DEPC-Treated Water</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>750024</td>
			<td>UltraPure DEPC-treated Water is suitable for use with RNA. It is prepared by incubating with 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC), and is then autoclaved to remove the DEPC. Sterile filtered.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of cytoplasmic and nuclear long rnas from primary and cultured cells

세포 내 구성 요소의 분리는 수년 동안 세포 생물학의 핵심 도구였으며 그 위치가 기능에 어떤 영향을 미칠 수 있는지에 대한 유용한 통찰력을 제공할 수 있었습니다. 특히, 핵 및 세포질 RNA의 분리는 암세포와 약물의 새로운 표적을 찾는 맥락에서 중요해졌습니다. 핵-세포질 RNA 추출을 위한 키트를 구입하는 것은 일반적인 실험실 환경에서 필요한 많은 재료를 찾을 수 있는 경우 비용이 많이 들 수 있습니다. 더 비싼 키트나 기타 시간이 많이 소요되는 공정을 대체할 수 있는 본 방법을 사용하면 수제 용해 완충액, 벤치탑 원심분리기 및 RNA 분리 정제 컬럼만 있으면 핵 및 세포질 RNA를 분리할 수 있습니다. 용해 완충액은 핵막의 무결성에 영향을 미치지 않고 세포의 외막을 부드럽게 용해시켜 세포 내 구성 요소를 방출하는 데 사용됩니다. 그런 다음 핵은 용해 용액보다 높은 밀도를 갖기 때문에 간단한 원심분리 단계로 분리할 수 있습니다. 원심분리는 밀도 차이에 따라 이러한 영역을 분리하여 핵의 세포 내 요소를 세포질의 하위 요소와 분리하는 데 사용됩니다. 원심분리를 통해 서로 다른 성분이 분리되면 RNA clean-up kit를 사용하여 RNA 함량을 정제하고 qPCR을 수행하여 분리 품질을 검증하고 서로 다른 분획의 핵 및 세포질 RNA의 양으로 정량화합니다. 통계적으로 유의미한 수준의 분리가 달성되어 프로토콜의 효과를 보여줍니다. 또한, 이 시스템은 다양한 유형의 RNA(총, 작은 RNA 등)의 분리에 적용할 수 있어 세포질-핵 상호작용에 대한 표적 연구를 가능하게 하고 핵과 세포질에 존재하는 RNA의 기능 차이를 이해하는 데 도움이 됩니다.

핵 및 세포질 분리가 달성되었는지 확인하기 위해 qPCR을 수행하여 결과를 검증했습니다. 그렇게 함으로써, 관심 영역에 특이적인 프라이머는 핵 및 세포질 분획 수준을 입증하는 데 활용되었습니다. 본 연구에서는 MALAT1과 TUG1을 각각 핵과 세포질 프라이머로 사용하였다. 함께, 그들은 핵 원소에 대한 양성 대조군으로 MALAT1을 사용하여 높은 수준의 핵 분획을 입증할 수 있는 반면, 세포질 분획은 낮...

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Preparation of Cytoplasmic and Nuclear Long RNAs from Primary and Cultured Cells

현재 프로토콜은 배양된 세포를 사용하여 핵 및 세포질 분획에서 RNA를 분리한 다음 qPCR을 사용하여 검증하는 효율적이고 유연한 방법을 제공합니다. 이것은 다른 RNA 준비 키트를 효과적으로 대체하는 역할을 합니다.

일차 세포와 배양된 세포에서 세포질 및 핵 Long RNA의 제조

The separation of intracellular components has been a key tool in cellular biology for many years now and has been able to provide useful insight into how ...

이 프로토콜은 핵과 세포질에서 정의된 생화학적 요소의 다양한 역할을 평가하고 다양한 세포주 내에서 이러한 도메인 간의 세포 내 상호 작용을 분석하는 데 필요합니다. 이 기술은 일반적인 실험실 장비와 시약을 사용하여 세포질 및 핵 분획을 보다 효율적으로 분리합니다. 이 프로토콜은 다른 프로토콜보다 저렴하고 빠르게 수행할 수 있습니다.세포질 및 핵 상호 작용에 대한 연구가 더 널리 퍼짐에 따라 세포 내 사건에 대한 국소화의 영향이 더 잘 이해될 수 있습니다. 세포질과 핵 사이의 교환을 분석 할 수 있으며, 핵 단백질에 대한 연구에서 알 수 있듯이 이러한 교환 중 특정 분자가 암 발병으로 이어질 수 있는지 여부를 나타냅니다. 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 용해 완충액의 농도를 적절한 농도로 수정하는 것입니다.용해 완충액의 사용은 주로 세포막의 파괴에 따라 달라지며 다양한 세포주에서 용해 완충액의 효과에 자연적인 변이가 있습니다. 시작하려면 2000G에서 5분 동안 원심분리를 통해 1.5밀리리터 튜브를 사용하여 세포를 펠릿으로 만듭니다. 펠릿을 300마이크로리터의 얼음처럼 차가운 용해 완충액에 재현탁합니다.그런 다음 튜브를 섭씨 4도에서 약 12, 000G의 속도로 2 분 동안 돌립니다. 상층액을 조심스럽게 제거하고 새 1.5 밀리리터 튜브에 넣으십시오. 나머지 펠릿은 핵 분획이 될 것입니다.다음에, 500 마이크로리터의 얼음처럼 차가운 PBS를 펠릿에 첨가하고, 실온에서 5분 동안 2000 G에서 원심분리한다. qPCR을 사용하여 구획의 분리를 확인하려면 먼저 시중에서 판매되는 키트를 사용하여 RNA를 보완 DNA로 전환합니다. 역전사효소 마스터 믹스를 준비합니다.템플릿 RNA를 추가합니다. thermocycler에서 반응을 배양합니다. 정량적 중합효소 연쇄 반응 및 분석을 수행합니다.cDNA 합성을 DEPC 물로 희석하여 최종 농도가 밀리리터당 20나노그램이 되도록 합니다. PCR 마스터 믹스를 사용하여 수동 지침을 사용하여 각 샘플에 대한 반응을 준비합니다. 세포질 및 핵 분획을 검출하는 데 필요한 상용 프로브를 확보합니다.MALAT1을 핵 마커로, TUG1을 세포질 마커로 사용합니다. 개별 표본에 대한 각 기술 반복실험에 대해 각 성분에 3을 곱하여 각 성분의 부피를 계산합니다. 각 핵 및 세포질 샘플에 대해 혼합 핵 분획과 MALAT1, 세포질 분획과 MALAT1, 핵 분획과 TUG1 및 세포질 분획을 획득합니다.용액을 혼합하기 위해 간략하게 와동하고 혼합물 20 마이크로리터를 광학 반응 플레이트의 각 웰로 옮깁니다. qPCR에 사용되는 투명 접착 필름으로 플레이트를 덮고 플레이트를 잠시 원심분리하여 기포를 제거한 다음 실온에서 5분 동안 300배 G에서 샘플을 회전시킵니다. 설계 및 해석 소프트웨어를 사용하여 사이클링 매개변수에 대한 표준 곡선을 선택합니다.qPCR 소프트웨어를 사용하여 설정 실행을 선택합니다. 데이터 파일 속성 페이지에서 메서드 및 입력 주기 매개 변수를 선택합니다. 사이클 파라미터를 입력한 후 플레이트 탭을 선택하고 실행할 샘플을 입력합니다.실행 시작을 선택합니다. 실행이 완료되면 샘플 이름, 목표 이름 및 정량화 주기가 포함된 데이터 스프레드시트를 만듭니다. MALAT1 샘플로 시작하여 핵 분율을 계산합니다.MALAT1 핵 분획에서 MALAT1 세포질 분획을 뺍니다. MALAT1 샘플을 계속 사용하여 세포질 분획을 계산합니다. MALAT1 세포질 분획에서 MALAT1 핵 분획을 뺀 다음 음성 델타 CQ로 올린 두 가지를 계산합니다. TUG1 표본을 사용하여 계산을 수행합니다.TUG1이 세포질 요소에 대한 양성 대조군으로 존재하는 경우, 세포질 분획 수준은 핵 분획 수준보다 높을 것으로 예상됩니다. MALAT1이 있는 샘플에서 세포질 분획 수준이 관찰되는 음성 결과. 이는 핵 분획에서 분리된 RNA의 오염을 나타내며, 잠재적으로 용해 농도가 너무 낮거나 너무 높기 때문입니다.MALAT1 및 TUG1은 웨스턴 블랏 및 RNA 전기영동을 통해 확인된 바와 같이 핵 및 세포질 분리와 가장 높은 상관관계를 나타내어 시료의 순도 및 품질을 확인하였다. 또한, 핵 및 세포질 추출물의 순도는 라민을 핵 분획의 마커로 사용하고 알파-튜불린을 세포질 분획의 양성 마커로 사용하는 웨스턴 블롯으로 입증할 수 있습니다. 세포질 RNA 전기영동에서 피크가 관찰되지 않았으며, 이는 세포질 RNA 샘플에서 고품질이며 오염이 거의 또는 전혀 없음을 보여줍니다.용해 완충액의 사용은 적절한 분획을 위해 매우 중요하며 용해 완충액 농도를 원하는 관심 세포주에 최적화하는 것이 필수적입니다. 이 기술은 다양한 연구 주제에 광범위하게 적용할 수 있는 핵 및 세포질 상호 작용에 대한 표적 연구를 가능하게 하고 특정 생물학적 요소의 국소화가 기능과 어떻게 상관관계가 있는지 더 잘 이해할 수 있도록 합니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood

캡처 및 혈액에서 실행 가능한 순환 종양 세포의 릴리스

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

연구

암 연구학

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

준비 및 췌장암 세포 및 섬유 아 세포의 3 차원 회전 타원 체 공동 문화의 변화 분석 결과

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

말 초 혈액 Monocytes 유 방 암 세포 라인 공동 경작에서 Osteoclastogenesis의 인간의 전 임상 모델의 개발

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

원심 Elutriation에 의해 다른 세포 주기 단계에서 기본 급성 림프 구성 백혈병 세포의 준비

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

순환 종양 세포를 캡처에 대 한 의료 와이어를 사용 하 여 종양 세포의 특성: 면역 형광 DNA 물고기 기반으로 3 차원 접근

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

An Orthotopic Endometrial Cancer Model with Retroperitoneal Lymphadenopathy Made From In Vivo Propagated and Cultured VX2 Cells

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Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

모 세관 전기 영동-질량 분 광 법에의 한 대사체학 분석을 위해 배양 된 부착 세포 로부터 수성 대사 산물의 추출

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

핵/세포질 단백질 인신 매매를 모니터링하기 위한 1차 만성 림프구성 백혈병 세포의 세포 분열

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

인간 결장 암 세포에 있는 DNA 손상 및 복구 Foci의 면역 형광 화상 진찰

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Measurement of the Compressibility of Cell and Nucleus Based on Acoustofluidic Microdevice

음향유체 마이크로장치를 기반으로 한 세포 및 핵의 압축성 측정

Cell mechanics play an important role in tumor metastasis, malignant transformation of cells, and radiosensitivity. During these processes, studying the ...