Name: preparation of cytoplasmic and nuclear long rnas from primary and cultured cells
Uploaded: 2023-04-07T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Cytoplasmic and Nuclear Long RNAs from Primary and Cultured Cells at JoVE.com

Støttet av tilskudd fra American Society of Hematology, Robert Wood Johnson Foundation, Doris Duke Charitable Foundation, Edward P. Evans Foundation og National Cancer Institute (1K08CA230319).

K562-celler brukes til denne studien. Denne protokollen er optimalisert for å fungere for 1 x 10 6-5 x 106 millioner celler. Prosedyren kan imidlertid skaleres opp for større cellemengder ved å øke volumene på riktig måte.
1. Klargjøring av 0,25x lysebuffer
<ol><li>Klargjør 0,25x lysebuffer ved å blande følgende komponenter i tabell 1A. MERK: Prøver krever ca. 300 μL 0,25x lysebuffer. Anbefalt volum = antall prøver x 300...

<ol>
	<li>Conrad, T., Orom, U. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+fractionation+and+isolation+of+chromatin-associated+RNA.">Cellular fractionation and isolation of chromatin-associated RNA.</a> Methods in Molecular Biology. 1468, 1-9 (2017).</li><li>Bashirullah, A., Cooperstock, R. L., Lipshitz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+localization+in+development.">RNA localization in development.</a> Annual Review of Biochemistry. 67, 335-394 (1998).</li><li>Liu, X., Fagotto, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+separate+nuclear,+cytosolic,+and+membrane-associated+signaling+molecules+in+cultured+cells.">A method to separate nuclear, cytosolic, and membrane-associated signaling molecules in cultured cells.</a> Science Signaling. 4 (203), (2011).</li><li>Jansen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+localization:+message+on+the+move.">mRNA localization: message on the move.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (4), 247-256 (2001).</li><li>Carlevaro-Fita, J., Johnson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+positioning+system:+Understanding+long+noncoding+RNAs+through+subcellular+localization.">Global positioning system: Understanding long noncoding RNAs through subcellular localization.</a> Molecular Cell. 73 (5), 869-883 (2019).</li><li>Voit, E. O., Martens, H. A., Omholt, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=150+years+of+the+mass+action+law.">150 years of the mass action law.</a> PLOS Computational Biology. 11 (1), 1004012 (2015).</li><li>El-Tanani, M., Dakir el, H., Raynor, B., Morgan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+nuclear+export+in+cancer+and+resistance+to+chemotherapy.">Mechanisms of nuclear export in cancer and resistance to chemotherapy.</a> Cancers (Basel). 8 (3), 35 (2016).</li><li>Turner, J. G., Dawson, J., Sullivan, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+export+of+proteins+and+drug+resistance+in+cancer).">Nuclear export of proteins and drug resistance in cancer).</a> Biochemical Pharmacology. 83 (8), 1021-1032 (2012).</li><li>Boesenberg-Smith, K. A., Pessarakli, M. M., Wolk, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+DNA+yield+and+purity:+an+overlooked+detail+of+PCR+troubleshooting.">Assessment of DNA yield and purity: an overlooked detail of PCR troubleshooting.</a> Clinical Microbiology Newsletter. 34 (1), 1-6 (2012).</li><li>Taylor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+nuclear+export+signal+recognition+as+a+driver+of+oncogenesis+altered+nuclear+export+signal+recognition+drives+oncogenesis.">Altered nuclear export signal recognition as a driver of oncogenesis altered nuclear export signal recognition drives oncogenesis.</a> Cancer Discovery. 9 (10), 1452-1467 (2019).</li><li>Ayupe, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+biogenesis,+stability+and+sub-cellular+localization+of+lncRNAs+mapping+to+intragenic+regions+of+the+human+genome.">Global analysis of biogenesis, stability and sub-cellular localization of lncRNAs mapping to intragenic regions of the human genome.</a> RNA Biology. 12 (8), 877-892 (2015).</li><li>Ghuysen, J. -. M., Hakenbeck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacterial Cell Wall. , (1994).</li><li>Fersht, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Enzyme Structure and Mechanism. , (1985).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> How to win the battle with RNase. 2019 (2), (2019).</li><li>Blumberg, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+a+ribonuclease-free+environment.">Creating a ribonuclease-free environment.</a> Methods in Enzymology. 152, 20-24 (1987).</li><li>Abmayr, S. M., Yao, T., Parmely, T., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+nuclear+and+cytoplasmic+extracts+from+mammalian+cells.">Preparation of nuclear and cytoplasmic extracts from mammalian cells.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2006).</li><li>Taylor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selinexor,+a+first-in-class+XPO1+inhibitor,+is+efficacious+and+tolerable+in+patients+with+myelodysplastic+syndromes+refractory+to+hypomethylating+agents.">Selinexor, a first-in-class XPO1 inhibitor, is efficacious and tolerable in patients with myelodysplastic syndromes refractory to hypomethylating agents.</a> Blood. 132, 233 (2018).</li></ol>

Gjennom protokollen ble det tatt noen skritt for å optimalisere elementene for å være mest effektive for cellelinjen av interesse. Selv om trinnene i protokollen er relativt enkle, kan analyse og mindre justeringer under kritiske aspekter av protokollen være nødvendig. Det mest kritiske trinnet i protokollen er å endre konsentrasjonen av lysisbufferen til en riktig konsentrasjon basert på cellelinjen av interesse og det cellulære målet. Siden utnyttelsen av lysisbuffer i stor grad avhenger av forstyrrelsen av ce...

Cellulær fraksjonering i subcellulære komponenter muliggjør isolering og studier av definerte biokjemiske domener og hjelpemidler for å bestemme lokaliseringen av spesifikke cellulære prosesser og hvordan dette kan påvirke deres funksjon1. Isolering av RNA fra forskjellige intracellulære steder kan muliggjøre forbedret nøyaktighet av genetisk og biokjemisk analyse av transkripsjonsnivåhendelser og andre interaksjoner mellom kjernen og cytoplasma, som tjener som hovedformålet med gjeldende protokoll2. Denne protokollen ble utviklet for å sikre isolering av cytoplasmatiske og nukleære RNA for å bestemme deres respektive roller i kjernefysisk eksport og for å forstå hvordan subcellulær lokalisering av RNA i kjernen og cytoplasma kan påvirke deres funksjon i cellulære prosesser. Ved å bruke materialer fra en typisk laboratorieinnstilling var det mulig å oppnå nukleær og cytoplasmatisk fraksjonering mer effektivt og billigere enn tidligere etablerte protokoller uten å sette kvaliteten på resultatene i fare3.
I tillegg kan utvekslingen av molekyler mellom cytoplasma og kjernen studeres direkte ved å separere disse områdene. Mer spesifikt er forståelse av transkriptomet avgjørende for å forstå utvikling og sykdom. Imidlertid kan RNA være på forskjellige modningsnivåer til enhver tid og kan komplisere nedstrøms analyse. Denne protokollen tillater muligheten til å isolere RNA fra nukleære og cytoplasmatiske subcellulære fraksjoner, noe som kan hjelpe til med studier av RNA og muliggjøre en bedre forståelse av et bestemt RNA av interesse, for eksempel lokalisering av ikke-kodende RNA eller analyse av spleisekryss i kjernen.
Denne protokollen er optimalisert for å isolere cytoplasmatiske og nukleære lange RNAer, inkludert mRNAer, rRNA og lange ikke-kodende RNA (lncRNAer), på grunn av størrelsesselektiviteten til RNA-rensingskolonnen som brukes, som kan modifiseres for å isolere andre RNA av interesse. Tidligere var funksjonen til lange RNAer, som mRNA og lncRNA, sterkt avhengig av deres respektive lokalisering i cellen 4,5. Derfor har studiet av eksporten fra kjernen til subcellulære domener blitt mer målrettet mot å forstå hvilken rolle eksport av RNA eller andre cellulære komponenter kan ha på cellen. lncRNA tjener som et godt eksempel på dette, da deres oversettelse og påfølgende effekter i stor grad er avhengige av nærhet og interaksjoner med andre former for RNA6. Videre er utveksling av cellulære elementer mellom nukleære og cytoplasmatiske regioner knyttet til resistensmekanismer mot ulike kreftbehandlinger7. Isoleringen av intracellulære rom har gjort det mulig å utvikle kjernefysiske eksporthemmere, noe som har redusert effekten av resistensmekanismer mot forskjellige terapier8.
Etter separering av nukleært og cytoplasmatisk RNA utføres trinn for å rense RNA av interesse. Siden RNA-rensesett ofte finnes i laboratorier og fungerer for å rense og isolere lange RNA, tjener de formålet med denne protokollen godt. For RNA-rensing er generering av 260: 280-forhold større enn 1,8 avgjørende for å sikre kvaliteten på prøver for RNA-sekvensering eller andre lignende prosedyrer som krever høye nivåer av renhet og isolasjon. Uregelmessige 260:280-verdier indikerer fenolforurensning, noe som viser dårlig isolasjon og gir unøyaktige resultater9.
Når RNA-rensingen er fullført og 260:280-verdiene er bekreftet å være over et akseptabelt område, ble qPCR brukt til å validere isolasjonsresultatene av nukleære og cytoplasmatiske fraksjoner. Ved å gjøre dette ble primere som var spesifikke for interesseområdet brukt til å demonstrere nukleære og cytoplasmatiske fraksjoneringsnivåer. I denne protokollen ble MALAT1 og TUG1 brukt som henholdsvis nukleære og cytoplasmatiske markører10. Sammen tillater de demonstrasjon av høye nivåer av nukleær fraksjonering med MALAT1, mens cytoplasmatisk fraksjonering forventes å være lav. Omvendt, når TUG1 brukes, forventes cytoplasmatiske fraksjoneringsnivåer å være høyere enn nukleære fraksjoneringsnivåer.
Ved hjelp av denne protokollen var det mulig å isolere RNA basert på deres virkningsposisjon i cellen. På grunn av utbredt tilgang til mange materialer og utnyttelse av bare lysisbuffer og tetthetsbaserte sentrifugeringsteknikker under dette eksperimentet, er anvendelighet for andre RNA-typer og andre cellulære komponenter utbredt. Dette kan gi viktig informasjon ved å belyse stedsspesifikke uttrykkshendelser som ellers ikke ville kunne skilles uten separasjon.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agilent Tapestation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991BA</td>
			<td>The Agilent TapeStation system is an automated electrophoresis solution for the sample quality control of DNA and RNA samples.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Nonidet P-40</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>28324</td>
			<td>Used in the making of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mM Tris-Cl pH 8.0</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>15568025</td>
			<td>Used in the making of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALAT1 GE Assay</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>Hs00273907_s1</td>
			<td>Utilized for confirmation of Nuclear fraction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>4326659</td>
			<td>The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>4311971</td>
			<td>The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate during qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012-023</td>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) is a balanced salt solution that is used for a variety of cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue samples, diluting cells for counting, and preparing reagents.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen RNA Clean Up Kit-Rneasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td>RNA cleanup kits enable efficient RNA cleanup of enzymatic reactions and cleanup of RNA purified by different methods. Includes RW1, RLT, RW1 buffers mentioned throughout protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>A43180</td>
			<td>qPCR software utilized during protocol. Includes Design and Analysis Software for analyzing fractionation samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RLT Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>Lysis Buffer from RNA clean-up kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPE Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1018013</td>
			<td>Wash Buffer from RNA clean-up kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RW1 Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1053394</td>
			<td>Wash Buffer from RNA clean-up kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman Gene Expression Assays</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays represent the largest collection of predesigned assays in the industry with over 2.8 million assays across 32 eukaryotic species and numerous microbes. TaqMan Gene Expression assays enable you to get results fast with no time wasted optimizing SYBR Green primers and no extra time spent running and analyzing melt curves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>4305719</td>
			<td>TaqMan Universal PCR Master Mix is the ideal reagent solution when you need a master mix for multiple 5&#39; nuclease DNA applications. Applied Biosystems reagents have been validated with TaqMan assays and Applied Biosystems real-time systems to ensure sensitive, accurate, and reliable performance every time.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUG1 GE Assay</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>Hs00215501_m1</td>
			<td>Utilized for confirmation of Cytoplasmic fraction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DEPC-Treated Water</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>750024</td>
			<td>UltraPure DEPC-treated Water is suitable for use with RNA. It is prepared by incubating with 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC), and is then autoclaved to remove the DEPC. Sterile filtered.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of cytoplasmic and nuclear long rnas from primary and cultured cells

Separasjonen av intracellulære komponenter har vært et sentralt verktøy i cellebiologi i mange år nå, og har vært i stand til å gi nyttig innsikt i hvordan deres plassering kan påvirke deres funksjon. Spesielt har separasjonen av nukleært og cytoplasmatisk RNA blitt viktig i sammenheng med kreftceller og søken etter å finne nye mål for medisiner. Innkjøpssett for kjernefysisk-cytoplasmatisk RNA-ekstraksjon kan være kostbart når mange av de nødvendige materialene finnes i en typisk laboratorieinnstilling. Ved å bruke den nåværende metoden, som kan erstatte dyrere sett eller andre tidkrevende prosesser, er det bare nødvendig med en hjemmelaget lysisbuffer, en stasjonær sentrifuge og RNA-isolasjonsrensingskolonner for å isolere nukleært og cytoplasmatisk RNA. Lysisbuffer brukes til å forsiktig lyse cellens ytre membran uten å påvirke integriteten til den nukleære konvolutten, noe som gjør det mulig å frigjøre sine intracellulære komponenter. Deretter kan kjernene isoleres ved et enkelt sentrifugeringstrinn siden de har en høyere tetthet enn lysisløsningen. Sentrifugering benyttes til å skille disse områdene basert på deres tetthetsforskjeller for å isolere subcellulære elementer i kjernen fra de i cytoplasma. Når sentrifugeringen har isolert de forskjellige komponentene, brukes et RNA-oppryddingssett for å rense RNA-innholdet, og qPCR utføres for å validere separasjonskvaliteten, kvantifisert av mengden nukleært og cytoplasmatisk RNA i de forskjellige fraksjonene. Statistisk signifikante nivåer av separasjon ble oppnådd, noe som illustrerer protokollens effektivitet. I tillegg kan dette systemet tilpasses for isolering av forskjellige typer RNA (totalt, lite RNA, etc.), noe som muliggjør målrettet studie av cytoplasma-kjerneinteraksjoner, og hjelpemidler til å forstå forskjellene i funksjonen til RNA som ligger i kjernen og cytoplasma.

For å sikre at nukleær og cytoplasmatisk isolasjon var oppnådd, ble det utført en qPCR for å validere resultatene. Ved å gjøre dette ble primere som var spesifikke for interesseområdet benyttet for å demonstrere nukleære og cytoplasmatiske fraksjoneringsnivåer. I denne studien ble MALAT1 og TUG1 brukt som henholdsvis nukleære og cytoplasmatiske primere. Sammen tillater de demonstrasjon av høye nivåer av nukleær fraksjonering med MALAT1 som en positiv kontroll for nukleære elementer, mens cytoplasmatisk fr...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Cytoplasmic and Nuclear Long RNAs from Primary and Cultured Cells at JoVE.com

Preparation of Cytoplasmic and Nuclear Long RNAs from Primary and Cultured Cells

Den nåværende protokollen tilbyr en effektiv og fleksibel metode for å isolere RNA fra nukleære og cytoplasmatiske fraksjoner ved bruk av dyrkede celler, og deretter validere ved hjelp av qPCR. Dette fungerer effektivt som en erstatning for andre RNA-forberedelsessett.

Fremstilling av cytoplasmatiske og nukleære lange RNA fra primære og dyrkede celler

The separation of intracellular components has been a key tool in cellular biology for many years now and has been able to provide useful insight into how ...

Denne protokollen er nødvendig for å evaluere de forskjellige rollene til definerte biokjemiske elementer i kjernen og cytoplasma og for å analysere intracellulære interaksjoner mellom disse domenene innenfor forskjellige cellelinjer. Denne teknikken benytter vanlig laboratorieutstyr og reagenser for mer effektivt å skille cytoplasmatiske og nukleære fraksjoner. Denne protokollen kan gjøre det billigere og raskere enn andre protokoller.Etter hvert som studier på cytoplasmatiske og nukleære interaksjoner blir mer utbredt, kan virkningen av lokalisering på intracellulære hendelser bli bedre forstått. Utvekslingen mellom cytoplasma og kjernen kan analyseres, noe som indikerer om visse molekyler under disse utvekslingene kan føre til kreftutvikling, som studier på nukleære proteiner har indikert. Det mest kritiske trinnet i protokollen er å endre konsentrasjonen av lysisbufferen til en riktig konsentrasjon.Siden bruken av lysisbuffer i stor grad avhenger av forstyrrelsen av cellemembraner, og det er naturlige varianter i effektiviteten av lysisbuffer på forskjellige cellelinjer. For å begynne, pellet cellene, ved hjelp av 1,5 milliliter rør via sentrifugering i fem minutter ved 2000 G.Kast supernatanten ved hjelp av en aspirasjonspipette. Resuspender pelleten i 300 mikroliter iskald lysisbuffer.Deretter spinner du rørene med en hastighet på rundt 12.000 G ved fire grader Celsius i to minutter. Fjern forsiktig supernatanten og legg den i et nytt 1,5 milliliter rør. Den gjenværende pelleten vil være kjernefraksjonen.Deretter tilsettes 500 mikroliter iskald PBS til pelleten og sentrifugen ved 2000 G i fem minutter ved romtemperatur. For å bekrefte separasjonen av rommene ved hjelp av qPCR, konverter først RNA til gratis DNA ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig sett. Klargjør revers transkriptase masterblanding.Legg til mal-RNA. Inkubere reaksjoner i en termosyklist. Fortsett for å utføre kvantitativ polymerasekjedereaksjon og analyse.Start med å fortynne cDNA-syntesen med DEPC-vann for å ha en endelig konsentrasjon på 20 nanogram per milliliter. Bruk en PCR-masterblanding, klargjør reaksjonen for hver prøve ved hjelp av manuelle instruksjoner. Skaff kommersielle sonder som er nødvendige for å oppdage cytoplasmatisk og nukleær fraksjonering.Bruk MALAT1 som nukleær markør og TUG1 som cytoplasmatisk markør. Beregn hver komponents volum ved å multiplisere hver komponent med tre for hver av de tekniske replikatene for den enkelte prøve. For hver nukleær og cytoplasmatisk prøve, oppnå blandingene nukleær fraksjon med MALAT1, cytoplasmatisk fraksjon med MALAT1, nukleær fraksjon med TUG1 og cytoplasmatisk fraksjon med TUG1.Vortex kort for å blande løsninger og overføre 20 mikroliter av blandingen til hver brønn i en optisk reaksjonsplate. Dekk platen med en klar limfilm som brukes til qPCR og sentrifuge platen kort for å eliminere luftbobler, og spinn deretter prøven ned ved 300 ganger G i fem minutter ved romtemperatur. Ved hjelp av design- og analyseprogramvare velger du standardkurven for syklingsparametrene.Bruk qPCR-programvaren til å velge installasjonskjøring. På siden for egenskaper for datafil velger du parametere for metode og inndatasyklus. Når du har lagt inn syklusparametere, velger du platefanen og skriver inn prøvene som skal kjøres.Velg start kjøring. Når kjøringen er fullført, oppretter du et dataregneark med eksempelnavnet, målnavnet og kvantifiseringssyklusen. Begynn med MALAT1-prøvene for å beregne kjernefraksjonen.Trekk MALAT1 cytoplasmatisk fraksjon fra MALAT1 nukleær fraksjon. Fortsett med MALAT1-prøvene for å beregne cytoplasmatisk fraksjon. Trekk MALAT1 nukleær fraksjon fra MALAT1 cytoplasmatisk fraksjon og beregn deretter de to hevede til negative delta CQ. Utfør beregningene med TUG1-prøver.Når TUG1 er tilstede som en positiv kontroll for cytoplasmatiske elementer, forventes cytoplasmatiske fraksjoneringsnivåer å være høyere enn nukleære fraksjoneringsnivåer. Et negativt resultat der nivåer av cytoplasmatisk fraksjonering er observert i prøven med MALAT1. Dette indikerer forurensning av RNA isolert fra kjernefraksjonen, potensielt på grunn av lysiskonsentrasjoner som er for lave eller for høye.MALAT1 og TUG1 viste den høyeste korrelasjonen med nukleær og cytoplasmatisk separasjon som bekreftet gjennom en Western blot og RNA-elektroforese, som bekreftet renheten og kvaliteten på prøvene. I tillegg kan renheten av nukleære og cytoplasmatiske ekstrakter demonstreres av en vestlig blot ved bruk av lamin som markør for nukleær fraksjon og alfa-tubulin som en positiv markør for cytoplasmatisk fraksjon. Ingen topp ble observert i cytoplasmatisk RNA-elektroforese, som demonstrerte høy kvalitet og liten eller ingen forurensning i cytoplasmatisk RNA-prøve.Bruken av lysisbuffer er avgjørende for riktig fraksjonering, og optimalisering av lysisbufferkonsentrasjonen til ønsket cellelinje av interesse er avgjørende. Denne teknikken muliggjør målrettet studie av nukleær og cytoplasmatisk interaksjon, som er allment anvendelig for en rekke forskningsemner og muliggjør en bedre forståelse av hvordan lokalisering av spesifikke biologiske elementer kan korrelere med deres funksjon.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood

Capture and Release av Levedyktige Sirkulasjonstumorceller fra Blood

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Forberedelse og metabolske analysen av 3-dimensjonale Spheroid co kulturer av kreft i bukspyttkjertelen celler og fibroblaster

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

Utviklingen av en menneskelig prekliniske modell av Osteoclastogenesis fra perifert blod monocytter co kultivert med bryst kreftcelle linjer

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

Forberedelse av primære akutt lymfatisk leukemi celler i forskjellige cellen syklus faser av sentrifugal Elutriation

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

Karakteristikk av tumorceller bruke en medisinsk ledning for å fange sirkulerende kreftceller: en 3D tilnærming basert på Immunofluorescence og DNA fisk

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

An Orthotopic Endometrial Cancer Model with Retroperitoneal Lymphadenopathy Made From In Vivo Propagated and Cultured VX2 Cells

En Orthotopic livmor Cancer modell med retroperitoneal lymfadenopati laget fra in vivo spredte og kultivert VX2 Cells

Endometrial cancer is the most common gynecologic malignancy in North America and the incidence is rising worldwide. Treatment consists of surgery with or ...

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Ekstraksjon av vandig metabolitter fra kultivert tilhenger Cells for Metabolomic analyse av kapillær elektroforese-Mass massespektrometri

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

Subcellulære Fraksjonering av primær kronisk lymfatisk leukemi celler til å overvåke kjernefysisk/cytoplasmatiske protein smugling

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Immunofluorescens Avbildning av DNA-skade og reparasjon av foci i humane tykktarmskreftceller

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Measurement of the Compressibility of Cell and Nucleus Based on Acoustofluidic Microdevice

Måling av kompressibiliteten til celle og kjerne basert på akustofluidisk mikrodevice

Cell mechanics play an important role in tumor metastasis, malignant transformation of cells, and radiosensitivity. During these processes, studying the ...