Name: preparation of cytoplasmic and nuclear long rnas from primary and cultured cells
Uploaded: 2023-04-07T13:20:00
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Con el apoyo de subvenciones de la Sociedad Americana de Hematología, la Fundación Robert Wood Johnson, la Fundación Caritativa Doris Duke, la Fundación Edward P. Evans y el Instituto Nacional del Cáncer (1K08CA230319).

Las células K562 se utilizan para el presente estudio. Este protocolo ha sido optimizado para funcionar para 1 x 10 6-5 x 106 millones de células. Sin embargo, el procedimiento se puede ampliar para cantidades de celdas más grandes aumentando los volúmenes adecuadamente.
1. Preparación del tampón de lisis 0.25x
<ol><li>Prepare el tampón de lisis 0.25x mezclando los siguientes componentes proporcionados en la Tabla 1A. NOTA: La...

<ol>
	<li>Conrad, T., Orom, U. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+fractionation+and+isolation+of+chromatin-associated+RNA.">Cellular fractionation and isolation of chromatin-associated RNA.</a> Methods in Molecular Biology. 1468, 1-9 (2017).</li><li>Bashirullah, A., Cooperstock, R. L., Lipshitz, H. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+nuclear+and+cytoplasmic+extracts+from+mammalian+cells.">Preparation of nuclear and cytoplasmic extracts from mammalian cells.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2006).</li><li>Taylor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selinexor,+a+first-in-class+XPO1+inhibitor,+is+efficacious+and+tolerable+in+patients+with+myelodysplastic+syndromes+refractory+to+hypomethylating+agents.">Selinexor, a first-in-class XPO1 inhibitor, is efficacious and tolerable in patients with myelodysplastic syndromes refractory to hypomethylating agents.</a> Blood. 132, 233 (2018).</li></ol>

A lo largo del protocolo, se tomaron algunas medidas para optimizar los elementos para que sean más efectivos para la línea celular de interés. Si bien los pasos dentro del protocolo son relativamente sencillos, puede ser necesario un análisis y ajustes menores durante los aspectos críticos del protocolo. El paso más crítico en el protocolo es modificar la concentración del tampón de lisis a una concentración adecuada basada en la línea celular de interés y el objetivo celular. Dado que la utilización del ta...

El fraccionamiento celular en componentes subcelulares permite el aislamiento y estudio de dominios bioquímicos definidos y ayuda a determinar la localización de procesos celulares específicos y cómo esto puede afectar su función1. El aislamiento de ARN de diferentes ubicaciones intracelulares puede permitir una mayor precisión del análisis genético y bioquímico de los eventos a nivel de transcripción y otras interacciones entre el núcleo y el citoplasma, que sirve como el propósito principal del protocolo actual2. Este protocolo fue desarrollado para asegurar el aislamiento de ARN citoplasmáticos y nucleares para determinar sus respectivos roles en la exportación nuclear y para comprender cómo la localización subcelular de ARN en el núcleo y el citoplasma puede afectar su función en los procesos celulares. Utilizando materiales de un entorno típico de laboratorio, fue posible lograr el fraccionamiento nuclear y citoplasmático de manera más efectiva y menos costosa que los protocolos previamente establecidos sin poner en peligro la calidad de los resultados3.
Además, el intercambio de moléculas entre el citoplasma y el núcleo se puede estudiar directamente separando estas regiones. Más específicamente, comprender el transcriptoma es esencial para comprender el desarrollo y la enfermedad. Sin embargo, los ARN pueden estar en diferentes niveles de maduración en un momento dado y pueden complicar el análisis posterior. Este protocolo permite la capacidad de aislar ARN de fracciones subcelulares nucleares y citoplasmáticas, lo que puede ayudar en los estudios de ARN y permitir una mejor comprensión de un ARN particular de interés, como la localización de ARN no codificantes o el análisis de uniones de empalme dentro del núcleo.
Este protocolo ha sido optimizado para aislar ARN largos citoplasmáticos y nucleares, incluidos ARNm, ARNr y ARN largos no codificantes (lncRNAs), debido a la selectividad de tamaño de la columna de purificación de ARN utilizada, que puede modificarse para aislar otros ARN de interés. Anteriormente, la función de los ARN largos, como los ARNm y los ARNlnc, dependía en gran medida de su respectiva localización dentro de la célula 4,5. Por lo tanto, el estudio de la exportación del núcleo a los dominios subcelulares se ha dirigido más hacia la comprensión del papel que la exportación de ARN u otros componentes celulares puede tener en la célula. Los lncRNAs sirven como un excelente ejemplo de esto, ya que su traducción y efectos posteriores dependen en gran medida de la proximidad y las interacciones con otras formas de ARN6. Además, el intercambio de elementos celulares entre las regiones nuclear y citoplasmática está relacionado a mecanismos de resistencia a diversos tratamientos contra el cáncer7. El aislamiento de compartimentos intracelulares ha permitido el desarrollo de inhibidores de la exportación nuclear, lo que ha disminuido los efectos de los mecanismos de resistencia a diferentes terapias8.
Después de separar el ARN nuclear y citoplasmático, se realizan pasos para purificar el ARN de interés. Dado que los kits de purificación de ARN se encuentran comúnmente dentro de los laboratorios y funcionan para purificar y aislar ARN largos, sirven bien al propósito de este protocolo. Para la purificación de ARN, la generación de proporciones 260:280 superiores a 1,8 es fundamental para garantizar la calidad de las muestras para la secuenciación de ARN u otros procedimientos similares que requieren altos niveles de pureza y aislamiento. Los valores irregulares de 260:280 indican contaminación por fenol, lo que demuestra un aislamiento deficiente y produce resultados inexactos9.
Una vez que se completa la purificación del ARN y se confirma que los valores de 260:280 están por encima de un rango aceptable, se utilizó qPCR para validar los resultados de aislamiento de las fracciones nucleares y citoplasmáticas. Al hacerlo, se utilizaron cebadores específicos para la región de interés para demostrar los niveles de fraccionamiento nuclear y citoplasmático. En este protocolo, MALAT1 y TUG1 fueron utilizados como marcadores nucleares y citoplasmáticos, respectivamente10. Juntos, permiten la demostración de altos niveles de fraccionamiento nuclear con MALAT1, mientras que se espera que el fraccionamiento citoplasmático sea bajo. Por el contrario, cuando se utiliza TUG1, se espera que los niveles de fraccionamiento citoplasmático sean más altos que los niveles de fraccionamiento nuclear.
Utilizando este protocolo, fue posible aislar ARN en función de su posición de acción dentro de la célula. Debido al acceso generalizado a muchos materiales y la utilización de solo tampón de lisis y técnicas de centrifugación basadas en la densidad durante este experimento, la aplicabilidad a otros tipos de ARN y otros componentes celulares está muy extendida. Esto puede proporcionar información importante al arrojar luz sobre eventos de expresión específicos de la ubicación que de otro modo serían indistinguibles sin separación.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agilent Tapestation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991BA</td>
			<td>The Agilent TapeStation system is an automated electrophoresis solution for the sample quality control of DNA and RNA samples.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Nonidet P-40</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>28324</td>
			<td>Used in the making of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mM Tris-Cl pH 8.0</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>15568025</td>
			<td>Used in the making of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALAT1 GE Assay</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>Hs00273907_s1</td>
			<td>Utilized for confirmation of Nuclear fraction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>4326659</td>
			<td>The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>4311971</td>
			<td>The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate during qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012-023</td>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) is a balanced salt solution that is used for a variety of cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue samples, diluting cells for counting, and preparing reagents.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen RNA Clean Up Kit-Rneasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td>RNA cleanup kits enable efficient RNA cleanup of enzymatic reactions and cleanup of RNA purified by different methods. Includes RW1, RLT, RW1 buffers mentioned throughout protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>A43180</td>
			<td>qPCR software utilized during protocol. Includes Design and Analysis Software for analyzing fractionation samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RLT Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>Lysis Buffer from RNA clean-up kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPE Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1018013</td>
			<td>Wash Buffer from RNA clean-up kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RW1 Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1053394</td>
			<td>Wash Buffer from RNA clean-up kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman Gene Expression Assays</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays represent the largest collection of predesigned assays in the industry with over 2.8 million assays across 32 eukaryotic species and numerous microbes. TaqMan Gene Expression assays enable you to get results fast with no time wasted optimizing SYBR Green primers and no extra time spent running and analyzing melt curves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>4305719</td>
			<td>TaqMan Universal PCR Master Mix is the ideal reagent solution when you need a master mix for multiple 5&#39; nuclease DNA applications. Applied Biosystems reagents have been validated with TaqMan assays and Applied Biosystems real-time systems to ensure sensitive, accurate, and reliable performance every time.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUG1 GE Assay</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>Hs00215501_m1</td>
			<td>Utilized for confirmation of Cytoplasmic fraction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DEPC-Treated Water</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>750024</td>
			<td>UltraPure DEPC-treated Water is suitable for use with RNA. It is prepared by incubating with 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC), and is then autoclaved to remove the DEPC. Sterile filtered.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of cytoplasmic and nuclear long rnas from primary and cultured cells

La separación de componentes intracelulares ha sido una herramienta clave en biología celular durante muchos años y ha sido capaz de proporcionar información útil sobre cómo su ubicación puede afectar su función. En particular, la separación del ARN nuclear y citoplasmático se ha vuelto importante en el contexto de las células cancerosas y la búsqueda de nuevos objetivos para los medicamentos. La compra de kits para la extracción de ARN citoplasmático nuclear puede ser costosa cuando muchos de los materiales requeridos se pueden encontrar dentro de un entorno de laboratorio típico. Usando el método actual, que puede reemplazar kits más costosos u otros procesos que consumen mucho tiempo, solo se necesita un amortiguador de lisis casero, una centrífuga de sobremesa y columnas de purificación de aislamiento de ARN para aislar el ARN nuclear y citoplasmático. El tampón de lisis se utiliza para lisar suavemente la membrana externa de la célula sin afectar la integridad de la envoltura nuclear, lo que permite liberar sus componentes intracelulares. Luego, los núcleos pueden aislarse mediante un simple paso de centrifugación, ya que poseen una densidad mayor que la solución de lisis. La centrifugación se utiliza para separar estas áreas en función de sus diferencias de densidad para aislar los elementos subcelulares en el núcleo de los del citoplasma. Una vez que la centrifugación ha aislado los diferentes componentes, se utiliza un kit de limpieza de ARN para purificar el contenido de ARN, y se realiza qPCR para validar la calidad de separación, cuantificada por la cantidad de ARN nuclear y citoplasmático en las diferentes fracciones. Se alcanzaron niveles estadísticamente significativos de separación, lo que ilustra la efectividad del protocolo. Además, este sistema se puede adaptar para el aislamiento de diferentes tipos de ARN (total, ARN pequeño, etc.), lo que permite el estudio específico de las interacciones citoplasma-núcleo y ayuda a comprender las diferencias en la función del ARN que residen en el núcleo y el citoplasma.

Para asegurar el aislamiento nuclear y citoplasmático, se realizó una qPCR para validar los resultados. Al hacerlo, se utilizaron cebadores específicos de la región de interés para demostrar los niveles de fraccionamiento nuclear y citoplasmático. En este estudio, MALAT1 y TUG1 se utilizaron como cebadores nucleares y citoplasmáticos, respectivamente. Juntos, permiten la demostración de altos niveles de fraccionamiento nuclear con MALAT1 como un control positivo para elementos nucleares, mientras que se espera qu...

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Preparation of Cytoplasmic and Nuclear Long RNAs from Primary and Cultured Cells

El presente protocolo ofrece un método eficiente y flexible para aislar ARN de fracciones nucleares y citoplasmáticas utilizando células cultivadas, y luego validar mediante qPCR. Esto sirve efectivamente como un reemplazo para otros kits de preparación de ARN.

Preparación de ARN largos citoplasmáticos y nucleares a partir de células primarias y cultivadas

The separation of intracellular components has been a key tool in cellular biology for many years now and has been able to provide useful insight into how ...

Este protocolo es necesario para evaluar los diferentes roles de elementos bioquímicos definidos en el núcleo y el citoplasma y para analizar las interacciones intracelulares entre estos dominios dentro de varias líneas celulares. Esta técnica utiliza equipos de laboratorio y reactivos comunes para separar de manera más eficiente las fracciones citoplasmáticas y nucleares. Este protocolo puede hacerlo de manera menos costosa y más rápida que otros protocolos.A medida que los estudios sobre las interacciones citoplasmáticas y nucleares se generalizan, el impacto de la localización en los eventos intracelulares puede comprenderse mejor. El intercambio entre el citoplasma y el núcleo puede ser analizado, indicando si ciertas moléculas durante estos intercambios pueden conducir al desarrollo del cáncer, como han indicado los estudios sobre proteínas nucleares. El paso más crítico en el protocolo es modificar la concentración del tampón de lisis a una concentración adecuada.Como el uso del tampón de lisis depende en gran medida de la interrupción de las membranas celulares y existen variantes naturales en la efectividad del tampón de lisis en diferentes líneas celulares. Para empezar, granular las células, utilizando tubos de 1,5 mililitros por centrifugación durante cinco minutos a 2000 G.Desechar el sobrenadante con una pipeta aspiradora. Resuspender el pellet en 300 microlitros de tampón de lisis helada.Luego, gire los tubos a una velocidad de alrededor de 12, 000 G a cuatro grados centígrados durante dos minutos. Retire con cuidado el sobrenadante y colóquelo en un nuevo tubo de 1,5 mililitros. El pellet restante será la fracción nuclear.A continuación, agregue 500 microlitros de PBS helado al pellet y centrifugar a 2000 G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Para confirmar la separación de los compartimentos usando qPCR, primero, convierta el ARN en ADN complementario utilizando un kit disponible comercialmente. Preparar la mezcla maestra de transcriptasa inversa.Agregar ARN de plantilla. Incubar reacciones en un termociclador. Proceder a realizar la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa y el análisis.Comience diluyendo la síntesis de ADNc con agua DEPC para tener una concentración final de 20 nanogramos por mililitro. Usando una mezcla maestra de PCR, prepare la reacción para cada muestra usando instrucciones manuales. Adquirir sondas comerciales necesarias para detectar fraccionamiento citoplasmático y nuclear.Utilice MALAT1 como marcador nuclear y TUG1 como marcador citoplasmático. Calcule el volumen de cada componente multiplicando cada componente por tres para cada una de las réplicas técnicas para la muestra individual. Para cada muestra nuclear y citoplasmática, adquirir las mezclas fracción nuclear con MALAT1, fracción citoplasmática con MALAT1, fracción nuclear con TUG1 y fracción citoplasmática con TUG1.Vortex brevemente para mezclar soluciones y transferir 20 microlitros de la mezcla a cada pocillo de una placa de reacción óptica. Cubra la placa con una película adhesiva transparente utilizada para qPCR y centrifugue la placa brevemente para eliminar las burbujas de aire, y luego gire la muestra a 300 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Utilizando software de diseño y análisis, seleccione la curva estándar para los parámetros de ciclismo.Con el software qPCR, seleccione setup run (ejecutar setup). En la página de propiedades del archivo de datos, seleccione el método y los parámetros del ciclo de entrada. Después de ingresar los parámetros del ciclo, seleccione la pestaña de la placa e ingrese las muestras que se ejecutarán.Seleccione iniciar ejecución. Una vez completada la ejecución, cree una hoja de cálculo de datos con el nombre de la muestra, el nombre del destino y el ciclo de cuantificación. Comience con las muestras MALAT1 para calcular la fracción nuclear.Resta la fracción citoplasmática MALAT1 de la fracción nuclear MALAT1. Continuar con las muestras MALAT1 para calcular la fracción citoplasmática. Reste la fracción nuclear MALAT1 de la fracción citoplasmática MALAT1 y luego calcule las dos elevadas a CQ delta negativa. Realizar los cálculos con muestras TUG1.Cuando TUG1 está presente como un control positivo para los elementos citoplasmáticos, se espera que los niveles de fraccionamiento citoplasmático sean más altos que los niveles de fraccionamiento nuclear. Un resultado negativo donde se observan niveles de fraccionamiento citoplasmático en la muestra con MALAT1. Esto indica contaminación de ARN aislado de la fracción nuclear, potencialmente debido a concentraciones de lisis que son demasiado bajas o demasiado altas.MALAT1 y TUG1 mostraron la mayor correlación con la separación nuclear y citoplasmática confirmada a través de un Western blot y electroforesis de ARN, que confirmó la pureza y calidad de las muestras. Además, la pureza de los extractos nucleares y citoplasmáticos se puede demostrar mediante un Western blot utilizando lamina como marcador para la fracción nuclear y alfa-tubulina como marcador positivo para la fracción citoplasmática. No se observó ningún pico en la electroforesis de ARN citoplasmático, demostrando alta calidad y poca o ninguna contaminación en la muestra de ARN citoplasmático.El uso de tampón de lisis es crítico para el fraccionamiento adecuado y es esencial optimizar la concentración del tampón de lisis a la línea celular de interés deseada. Esta técnica permite el estudio específico de la interacción nuclear y citoplasmática, que es ampliamente aplicable a una variedad de temas de investigación y permite una mejor comprensión de cómo la localización de elementos biológicos específicos puede correlacionarse con su función.

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