Name: preparation of cytoplasmic and nuclear long rnas from primary and cultured cells
Uploaded: 2023-04-07T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Cytoplasmic and Nuclear Long RNAs from Primary and Cultured Cells at JoVE.com

Amerikan Hematoloji Derneği, Robert Wood Johnson Vakfı, Doris Duke Hayırsever Vakfı, Edward P. Evans Vakfı ve Ulusal Kanser Enstitüsü'nün (1K08CA230319) bağışlarıyla desteklenmektedir.

Bu çalışmada K562 hücreleri kullanılmıştır. Bu protokol 1 x 106-5 x 106 milyon hücre için çalışacak şekilde optimize edilmiştir. Bununla birlikte, prosedür, hacimleri uygun şekilde artırarak daha büyük hücre miktarları için ölçeklendirilebilir.
1. 0.25x lizis tamponunun hazırlanması
<ol><li>Tablo 1A'da verilen aşağıdaki bileşenleri karıştırarak 0,25x lizis tamponu hazırlayın. NOT: Numuneler yaklaş...

<ol>
	<li>Conrad, T., Orom, U. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+fractionation+and+isolation+of+chromatin-associated+RNA.">Cellular fractionation and isolation of chromatin-associated RNA.</a> Methods in Molecular Biology. 1468, 1-9 (2017).</li><li>Bashirullah, A., Cooperstock, R. L., Lipshitz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+localization+in+development.">RNA localization in development.</a> Annual Review of Biochemistry. 67, 335-394 (1998).</li><li>Liu, X., Fagotto, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+separate+nuclear,+cytosolic,+and+membrane-associated+signaling+molecules+in+cultured+cells.">A method to separate nuclear, cytosolic, and membrane-associated signaling molecules in cultured cells.</a> Science Signaling. 4 (203), (2011).</li><li>Jansen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+localization:+message+on+the+move.">mRNA localization: message on the move.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (4), 247-256 (2001).</li><li>Carlevaro-Fita, J., Johnson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+positioning+system:+Understanding+long+noncoding+RNAs+through+subcellular+localization.">Global positioning system: Understanding long noncoding RNAs through subcellular localization.</a> Molecular Cell. 73 (5), 869-883 (2019).</li><li>Voit, E. O., Martens, H. A., Omholt, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=150+years+of+the+mass+action+law.">150 years of the mass action law.</a> PLOS Computational Biology. 11 (1), 1004012 (2015).</li><li>El-Tanani, M., Dakir el, H., Raynor, B., Morgan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+nuclear+export+in+cancer+and+resistance+to+chemotherapy.">Mechanisms of nuclear export in cancer and resistance to chemotherapy.</a> Cancers (Basel). 8 (3), 35 (2016).</li><li>Turner, J. G., Dawson, J., Sullivan, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+export+of+proteins+and+drug+resistance+in+cancer).">Nuclear export of proteins and drug resistance in cancer).</a> Biochemical Pharmacology. 83 (8), 1021-1032 (2012).</li><li>Boesenberg-Smith, K. A., Pessarakli, M. M., Wolk, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+DNA+yield+and+purity:+an+overlooked+detail+of+PCR+troubleshooting.">Assessment of DNA yield and purity: an overlooked detail of PCR troubleshooting.</a> Clinical Microbiology Newsletter. 34 (1), 1-6 (2012).</li><li>Taylor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+nuclear+export+signal+recognition+as+a+driver+of+oncogenesis+altered+nuclear+export+signal+recognition+drives+oncogenesis.">Altered nuclear export signal recognition as a driver of oncogenesis altered nuclear export signal recognition drives oncogenesis.</a> Cancer Discovery. 9 (10), 1452-1467 (2019).</li><li>Ayupe, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+biogenesis,+stability+and+sub-cellular+localization+of+lncRNAs+mapping+to+intragenic+regions+of+the+human+genome.">Global analysis of biogenesis, stability and sub-cellular localization of lncRNAs mapping to intragenic regions of the human genome.</a> RNA Biology. 12 (8), 877-892 (2015).</li><li>Ghuysen, J. -. M., Hakenbeck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacterial Cell Wall. , (1994).</li><li>Fersht, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Enzyme Structure and Mechanism. , (1985).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> How to win the battle with RNase. 2019 (2), (2019).</li><li>Blumberg, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+a+ribonuclease-free+environment.">Creating a ribonuclease-free environment.</a> Methods in Enzymology. 152, 20-24 (1987).</li><li>Abmayr, S. M., Yao, T., Parmely, T., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+nuclear+and+cytoplasmic+extracts+from+mammalian+cells.">Preparation of nuclear and cytoplasmic extracts from mammalian cells.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2006).</li><li>Taylor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selinexor,+a+first-in-class+XPO1+inhibitor,+is+efficacious+and+tolerable+in+patients+with+myelodysplastic+syndromes+refractory+to+hypomethylating+agents.">Selinexor, a first-in-class XPO1 inhibitor, is efficacious and tolerable in patients with myelodysplastic syndromes refractory to hypomethylating agents.</a> Blood. 132, 233 (2018).</li></ol>

Protokol boyunca, ilgilenilen hücre hattı için en etkili olacak öğeleri optimize etmek için bazı adımlar atıldı. Protokol içindeki adımlar nispeten basit olsa da, protokolün kritik yönleri sırasında analiz ve küçük ayarlamalar gerekli olabilir. Protokoldeki en kritik adım, lizis tamponunun konsantrasyonunu, ilgilenilen hücre hattına ve hücresel hedefe bağlı olarak uygun bir konsantrasyona değiştirmektir. Lizis tamponunun kullanımı büyük ölçüde hücre zarlarının bozulmasına bağlı old...

Hücre altı bileşenlere hücresel fraksiyonasyon, tanımlanmış biyokimyasal alanların izolasyonuna ve incelenmesine izin verir ve spesifik hücresel süreçlerin lokalizasyonunu ve bunun işlevlerini nasıl etkileyebileceğini belirlemeye yardımcı olur1. RNA'nın farklı hücre içi konumlardan izole edilmesi, transkripsiyon seviyesi olaylarının ve çekirdek ile sitoplazma arasındaki diğer etkileşimlerin genetik ve biyokimyasal analizinin doğruluğunun iyileştirilmesine izin verebilir ve bu da mevcut protokolün birincil amacı olarak hizmet eder2. Bu protokol, nükleer ihracattaki rollerini belirlemek ve nükleus ve sitoplazmadaki RNA'ların hücre altı lokalizasyonunun hücresel süreçlerdeki işlevlerini nasıl etkileyebileceğini anlamak için sitoplazmik ve nükleer RNA'ların izolasyonunu sağlamak için geliştirilmiştir. Tipik bir laboratuvar ortamındaki materyalleri kullanarak, sonuçların kalitesini tehlikeye atmadan nükleer ve sitoplazmik fraksiyonasyonu daha önce belirlenmiş protokollerden daha etkili ve daha ucuz bir şekilde elde etmek mümkün olmuştur3.
Ek olarak, sitoplazma ve çekirdek arasındaki moleküllerin değişimi, bu bölgeleri ayırarak doğrudan incelenebilir. Daha spesifik olarak, transkriptomu anlamak, gelişimi ve hastalığı anlamak için gereklidir. Bununla birlikte, RNA'lar herhangi bir zamanda farklı olgunlaşma seviyelerinde olabilir ve aşağı akış analizini zorlaştırabilir. Bu protokol, RNA'yı nükleer ve sitoplazmik hücre altı fraksiyonlardan izole etme yeteneğine izin verir, bu da RNA çalışmalarına yardımcı olabilir ve kodlamayan RNA'ların lokalizasyonu veya çekirdek içindeki ekleme kavşaklarının analizi gibi belirli bir RNA'nın daha iyi anlaşılmasını sağlar.
Bu protokol, kullanılan RNA saflaştırma kolonunun boyut seçiciliği nedeniyle, mRNA'lar, rRNA'lar ve uzun kodlamayan RNA'lar (lncRNA'lar) dahil olmak üzere sitoplazmik ve nükleer uzun RNA'ları izole etmek için optimize edilmiştir. Önceden, mRNA'lar ve lncRNA'lar gibi uzun RNA'ların işlevi, 4,5 hücresi içindeki ilgili lokalizasyonlarına büyük ölçüde bağlıydı. Bu nedenle, çekirdekten hücre altı alanlara yapılan ihracatın incelenmesi, RNA'nın veya diğer hücresel bileşenlerin ihraç edilmesinin hücre üzerindeki rolünü anlamaya yönelik daha hedefli hale gelmiştir. lncRNA'lar bunun en iyi örneği olarak hizmet eder, çünkü çevirileri ve sonraki etkileri büyük ölçüde RNA6'nın diğer formlarıyla yakınlık ve etkileşimlere dayanır. Ayrıca, nükleer ve sitoplazmik bölgeler arasındaki hücresel elementlerin değişimi, çeşitli kanser tedavilerine direnç mekanizmalarına bağlıdır7. Hücre içi bölmelerin izolasyonu, direnç mekanizmalarının farklı tedavilere etkilerini azaltan nükleer ihracat inhibitörlerinin geliştirilmesine izin vermiştir8.
Nükleer ve sitoplazmik RNA'yı ayırdıktan sonra, ilgilenilen RNA'yı saflaştırmak için adımlar atılır. RNA saflaştırma kitleri laboratuvarlarda yaygın olarak bulunduğundan ve uzun RNA'ları saflaştırmak ve izole etmek için işlev gördüğünden, bu protokolün amacına iyi hizmet ederler. RNA saflaştırması için, 1.8'den büyük 260:280 oranlarının üretilmesi, RNA dizilimi veya yüksek saflık ve izolasyon gerektiren diğer benzer prosedürler için numunelerin kalitesini sağlamak için kritik öneme sahiptir. Düzensiz 260:280 değerleri fenol kontaminasyonunu gösterir, zayıf izolasyon gösterir ve yanlış sonuçlar verir9.
RNA saflaştırması tamamlandıktan ve 260:280 değerlerinin kabul edilebilir bir aralığın üzerinde olduğu doğrulandıktan sonra, nükleer ve sitoplazmik fraksiyonların izolasyon sonuçlarını doğrulamak için qPCR kullanıldı. Bunu yaparken, nükleer ve sitoplazmik fraksiyonasyon seviyelerini göstermek için ilgili bölgeye özgü primerler kullanılmıştır. Bu protokolde MALAT1 ve TUG1 nükleer ve sitoplazmik belirteçler olarak sırasıyla10 kullanıldı. Birlikte, MALAT1 ile yüksek düzeyde nükleer fraksiyonasyonun gösterilmesine izin verirken, sitoplazmik fraksiyonasyonun düşük olması beklenir. Tersine, TUG1 kullanıldığında, sitoplazmik fraksiyonasyon seviyelerinin nükleer fraksiyonasyon seviyelerinden daha yüksek olması beklenir.
Bu protokolü kullanarak, RNA'ları hücre içindeki etki konumlarına göre izole etmek mümkündü. Bu deney sırasında birçok malzemeye yaygın erişim ve sadece lizis tamponu ve yoğunluğa dayalı santrifüj tekniklerinin kullanılması nedeniyle, diğer RNA tiplerine ve diğer hücresel bileşenlere uygulanabilirlik yaygındır. Bu, aksi takdirde ayrılmadan ayırt edilemeyecek konuma özgü ifade olaylarına ışık tutarak önemli bilgiler sağlayabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agilent Tapestation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991BA</td>
			<td>The Agilent TapeStation system is an automated electrophoresis solution for the sample quality control of DNA and RNA samples.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Nonidet P-40</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>28324</td>
			<td>Used in the making of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mM Tris-Cl pH 8.0</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>15568025</td>
			<td>Used in the making of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALAT1 GE Assay</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>Hs00273907_s1</td>
			<td>Utilized for confirmation of Nuclear fraction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>4326659</td>
			<td>The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>4311971</td>
			<td>The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate during qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012-023</td>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) is a balanced salt solution that is used for a variety of cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue samples, diluting cells for counting, and preparing reagents.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen RNA Clean Up Kit-Rneasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td>RNA cleanup kits enable efficient RNA cleanup of enzymatic reactions and cleanup of RNA purified by different methods. Includes RW1, RLT, RW1 buffers mentioned throughout protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>A43180</td>
			<td>qPCR software utilized during protocol. Includes Design and Analysis Software for analyzing fractionation samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RLT Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>Lysis Buffer from RNA clean-up kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPE Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1018013</td>
			<td>Wash Buffer from RNA clean-up kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RW1 Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1053394</td>
			<td>Wash Buffer from RNA clean-up kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman Gene Expression Assays</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays represent the largest collection of predesigned assays in the industry with over 2.8 million assays across 32 eukaryotic species and numerous microbes. TaqMan Gene Expression assays enable you to get results fast with no time wasted optimizing SYBR Green primers and no extra time spent running and analyzing melt curves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>4305719</td>
			<td>TaqMan Universal PCR Master Mix is the ideal reagent solution when you need a master mix for multiple 5&#39; nuclease DNA applications. Applied Biosystems reagents have been validated with TaqMan assays and Applied Biosystems real-time systems to ensure sensitive, accurate, and reliable performance every time.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUG1 GE Assay</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>Hs00215501_m1</td>
			<td>Utilized for confirmation of Cytoplasmic fraction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DEPC-Treated Water</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>750024</td>
			<td>UltraPure DEPC-treated Water is suitable for use with RNA. It is prepared by incubating with 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC), and is then autoclaved to remove the DEPC. Sterile filtered.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of cytoplasmic and nuclear long rnas from primary and cultured cells

Hücre içi bileşenlerin ayrılması, uzun yıllardır hücresel biyolojide önemli bir araç olmuştur ve konumlarının işlevlerini nasıl etkileyebileceğine dair yararlı bilgiler sağlayabilmiştir. Özellikle, nükleer ve sitoplazmik RNA'nın ayrılması, kanser hücreleri ve ilaçlar için yeni hedefler bulma arayışı bağlamında önemli hale gelmiştir. Nükleer-sitoplazmik RNA ekstraksiyonu için kitlerin satın alınması, gerekli malzemelerin çoğu tipik bir laboratuvar ortamında bulunabildiğinde maliyetli olabilir. Daha pahalı kitlerin veya diğer zaman alıcı işlemlerin yerini alabilen mevcut yöntemi kullanarak, nükleer ve sitoplazmik RNA'yı izole etmek için sadece ev yapımı bir lizis tamponu, bir tezgah üstü santrifüj ve RNA izolasyon saflaştırma sütunlarına ihtiyaç vardır. Lizis tamponu, nükleer zarfın bütünlüğünü etkilemeden hücrenin dış zarını nazikçe lize etmek için kullanılır ve hücre içi bileşenlerinin serbest bırakılmasına izin verir. Daha sonra, çekirdekler basit bir santrifüjleme adımıyla izole edilebilir, çünkü lizis çözeltisinden daha yüksek bir yoğunluğa sahiptirler. Santrifüjleme, çekirdekteki hücre altı elementleri sitoplazmadakilerden izole etmek için bu alanları yoğunluk farklılıklarına göre ayırmak için kullanılır. Santrifüjleme farklı bileşenleri izole ettikten sonra, RNA içeriğini saflaştırmak için bir RNA temizleme kiti kullanılır ve farklı fraksiyonlardaki nükleer ve sitoplazmik RNA miktarı ile ölçülen ayırma kalitesini doğrulamak için qPCR gerçekleştirilir. Protokolün etkinliğini gösteren istatistiksel olarak anlamlı ayrılma seviyelerine ulaşıldı. Ek olarak, bu sistem, sitoplazma-çekirdek etkileşimlerinin hedefli olarak incelenmesine izin veren ve çekirdek ve sitoplazmada bulunan RNA'nın işlevindeki farklılıkların anlaşılmasına yardımcı olan farklı RNA türlerinin (toplam, küçük RNA, vb.) İzolasyonu için uyarlanabilir.

Nükleer ve sitoplazmik izolasyonun sağlandığından emin olmak için, sonuçları doğrulamak için bir qPCR yapıldı. Bunu yaparken, nükleer ve sitoplazmik fraksiyonasyon seviyelerini göstermek için ilgilenilen bölgeye özgü primerler kullanılmıştır. Bu çalışmada MALAT1 ve TUG1 sırasıyla nükleer ve sitoplazmik primer olarak kullanılmıştır. Birlikte, nükleer elementler için pozitif bir kontrol olarak MALAT1 ile yüksek seviyelerde nükleer fraksiyonasyonun gösterilmesine izin verirken, sitoplazm...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Cytoplasmic and Nuclear Long RNAs from Primary and Cultured Cells at JoVE.com

Preparation of Cytoplasmic and Nuclear Long RNAs from Primary and Cultured Cells

Mevcut protokol, RNA'yı kültürlenmiş hücreler kullanarak nükleer ve sitoplazmik fraksiyonlardan izole etmek ve daha sonra qPCR kullanarak doğrulamak için etkili ve esnek bir yöntem sunmaktadır. Bu, etkili bir şekilde diğer RNA hazırlama kitlerinin yerine geçer.

Primer ve Kültürlü Hücrelerden Sitoplazmik ve Nükleer Uzun RNA'ların Hazırlanması

The separation of intracellular components has been a key tool in cellular biology for many years now and has been able to provide useful insight into how ...

Bu protokol, tanımlanmış biyokimyasal elementlerin çekirdek ve sitoplazmadaki farklı rollerini değerlendirmek ve bu alanlar arasındaki hücre içi etkileşimleri çeşitli hücre hatları içinde analiz etmek için gereklidir. Bu teknik, sitoplazmik ve nükleer fraksiyonları daha verimli bir şekilde ayırmak için yaygın laboratuvar ekipmanlarını ve reaktifleri kullanır. Bu protokol bunu diğer protokollerden daha ucuz ve daha hızlı yapabilir.Sitoplazmik ve nükleer etkileşimler üzerine yapılan çalışmalar yaygınlaştıkça, lokalizasyonun hücre içi olaylar üzerindeki etkisi daha iyi anlaşılabilir. Sitoplazma ve çekirdek arasındaki değişim, nükleer proteinler üzerine yapılan çalışmaların gösterdiği gibi, bu değişimler sırasında belirli moleküllerin kanser gelişimine yol açıp açamayacağını gösteren analiz edilebilir. Protokoldeki en kritik adım, lizis tamponunun konsantrasyonunu uygun bir konsantrasyona değiştirmektir.Lizis tamponunun kullanımı büyük ölçüde hücre zarlarının bozulmasına bağlı olduğundan ve lizis tamponunun farklı hücre hatları üzerindeki etkinliğinde doğal varyantlar vardır. Başlamak için, 2000 G.'de beş dakika boyunca santrifüjleme yoluyla 1.5 mililitrelik tüpler kullanarak hücreleri pelet edin G.Emper aspire edici bir pipet kullanarak süpernatantı atın. Peleti 300 mikrolitre buz gibi soğuk lizis tamponunda yeniden askıya alın.Ardından, tüpleri iki dakika boyunca dört santigrat derecede yaklaşık 12.000 G hızında döndürün. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve yeni bir 1,5 mililitrelik tüpe yerleştirin. Kalan pelet nükleer fraksiyon olacaktır.Daha sonra, pelete 500 mikrolitre buz gibi soğuk PBS ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 2000 G'de santrifüj yapın. qPCR kullanarak bölmelerin ayrılmasını doğrulamak için, önce RNA'yı ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanarak tamamlayıcı DNA'ya dönüştürün. Ters transkriptaz ana karışımını hazırlayın.Şablon RNA ekleyin. Bir termosiklustaki reaksiyonları inkübe edin. Kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu ve analizi yapmak için devam edin.Mililitre başına 20 nanogramlık bir nihai konsantrasyona sahip olmak için cDNA sentezini DEPC suyuyla seyreltmekle başlayın. Bir PCR ana karışımı kullanarak, manuel talimatları kullanarak her numune için reaksiyonu hazırlayın. Sitoplazmik ve nükleer fraksiyonasyonu tespit etmek için gerekli ticari probları edinin.Nükleer belirteç olarak MALAT1 ve sitoplazmik belirteç olarak TUG1 kullanın. Her bir numune için teknik çoğaltmaların her biri için her bir bileşeni üçle çarparak her bileşenin hacmini hesaplayın. Her nükleer ve sitoplazmik numune için, MALAT1 ile nükleer fraksiyon, MALAT1 ile sitoplazmik fraksiyon, TUG1 ile nükleer fraksiyon ve TUG1 ile sitoplazmik fraksiyon karışımlarını elde edin.Çözeltileri karıştırmak ve karışımın 20 mikrolitresini optik reaksiyon plakasının her bir kuyucuğuna aktarmak için kısaca vorteks. Plakayı qPCR için kullanılan şeffaf bir yapışkan filmle örtün ve hava kabarcıklarını gidermek için plakayı kısa bir süre santrifüj edin ve ardından numuneyi oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 kez G'de döndürün. Tasarım ve analiz yazılımını kullanarak, döngü parametreleri için standart eğriyi seçin.qPCR yazılımını kullanarak kurulum çalıştır'ı seçin. Veri dosyası özellikleri sayfasında, yöntem ve giriş döngüsü parametrelerini seçin. Döngü parametrelerini girdikten sonra, plaka sekmesini seçin ve çalıştırılacak örnekleri girin.Çalıştırmayı başlat'ı seçin. Çalıştırma tamamlandıktan sonra, örnek adı, hedef adı ve niceleme döngüsünü içeren bir veri elektronik tablosu oluşturun. Nükleer fraksiyonu hesaplamak için MALAT1 örnekleri ile başlayın.MALAT1 sitoplazmik fraksiyonunu MALAT1 nükleer fraksiyonundan çıkarın. Sitoplazmik fraksiyonu hesaplamak için MALAT1 örnekleriyle devam edin. MALAT1 nükleer fraksiyonunu MALAT1 sitoplazmik fraksiyonundan çıkarın ve ardından negatif delta CQ'ya yükseltilmiş ikisini hesaplayın. TUG1 numuneleri ile hesaplamaları gerçekleştirin.TUG1, sitoplazmik elementler için pozitif bir kontrol olarak mevcut olduğunda, sitoplazmik fraksiyonasyon seviyelerinin nükleer fraksiyonasyon seviyelerinden daha yüksek olması beklenir. MALAT1'li numunede sitoplazmik fraksiyonasyon seviyelerinin gözlendiği negatif bir sonuç. Bu, nükleer fraksiyondan izole edilen RNA'nın, potansiyel olarak çok düşük veya çok yüksek olan lizis konsantrasyonları nedeniyle kontaminasyonunu gösterir.MALAT1 ve TUG1, örneklerin saflığını ve kalitesini doğrulayan bir Batı lekesi ve RNA elektroforezi ile doğrulandığı gibi nükleer ve sitoplazmik ayırma ile en yüksek korelasyonu sergiledi. Ek olarak, nükleer ve sitoplazmik ekstraktların saflığı, nükleer fraksiyon için bir belirteç olarak lamin ve sitoplazmik fraksiyon için pozitif bir belirteç olarak alfa-tübülin kullanan bir Batı lekesi ile gösterilebilir. Sitoplazmik RNA elektroforezinde pik gözlenmedi, bu da sitoplazmik RNA örneğinde yüksek kalite ve çok az veya hiç kontaminasyon göstermedi.Lizis tamponunun kullanımı, uygun fraksiyonasyon için kritik öneme sahiptir ve lizis tamponu konsantrasyonunun, ilgilenilen istenen hücre hattına optimize edilmesi esastır. Bu teknik, çeşitli araştırma konularına yaygın olarak uygulanan nükleer ve sitoplazmik etkileşimin hedeflenen çalışmasına izin verir ve belirli biyolojik elementlerin lokalizasyonunun işlevleriyle nasıl ilişkili olabileceğinin daha iyi anlaşılmasını sağlar.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood

Yakalama ve Kan gelen Canlı Sirkülasyon Tümör Hücrelerinin Yayın

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

Kanser Araştırmaları

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Hazırlık ve pankreas kanseri hücreleri ve fibroblastlar 3 boyutlu küresel ortak kültürlerin metabolik tahlil

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

Osteoclastogenesis periferik kan monosit kültürlü meme kanseri hücre hatları ile birlikte gelen bir insan preklinik modelinin geliştirilmesi

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

Birincil Akut lenfoblastik lösemi hücreleri hazırlanmasında farklı hücre döngüsü aşamaları santrifüj Elutriation tarafından

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

Tümör hücrelerinin tümör hücreleri dolaşan yakalamak için tıbbi bir tel kullanarak karakterizasyonu: 3D bir yaklaşım tabanlı ayirt ve DNA balık

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

An Orthotopic Endometrial Cancer Model with Retroperitoneal Lymphadenopathy Made From In Vivo Propagated and Cultured VX2 Cells

Retroperitoneal Lenfadenopati li Ortotopik Endometriyal Kanser Modeli In Vivo Propagated ve Kültürlü VX2 Hücrelerinden Yapılmıştır

Endometrial cancer is the most common gynecologic malignancy in North America and the incidence is rising worldwide. Treatment consists of surgery with or ...

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Kılcal Elektroforez-kütle spektrometresi tarafından metabolomik analiz için kültürlü yapışan hücrelerden sulu metabolitlerin çıkarılması

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

Nükleer/Sitoplazmik Protein Ticaretini İzlemek Için Primer Kronik Lenfositik Lösemi Hücrelerinin Subsellüler Fraksiyonları

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

İnsan Kolon Kanseri Hücrelerinde DNA Hasarı ve Onarım Foci İmmünofloresan Görüntüleme

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Measurement of the Compressibility of Cell and Nucleus Based on Acoustofluidic Microdevice

Akustoakışkan Mikrocihaz Temelinde Hücre ve Çekirdeğin Sıkıştırılabilirliğinin Ölçülmesi

Cell mechanics play an important role in tumor metastasis, malignant transformation of cells, and radiosensitivity. During these processes, studying the ...