Denne metode til dissektion og immunfluorescens anvendes af mange C.elegans laboratorier. Det kan vedtages for at detektere ethvert protein, som et antistof eller mærket fusionsprotein er tilgængeligt for. Selvom det kræver en vis øvelse at få denne dissektion rigtigt, er denne protokol fleksibel og ligetil at fejlfinde.
For os fungerer DAPI-farvning altid, og vi kan normalt finde en tilstand, der virker for hvert antistof. Den største udfordring for denne teknik er dissektionstrinnet. Du skal arbejde hurtigt, men trygt for at få gode kimlinjeekstruderinger.
Øvelse er nøglen. Til at begynde med skal du placere et holdeglas på scenen i et dissekerende mikroskop og placere dækslippet oven på holdeglasset. Derefter pipetteres fire mikroliter af dissekeringsopløsningen ind i midten af dækslippet, og hold glideren flyttes til den ene side af scenen for at frigøre udsigten.
Vælg 10 til 20 hermafroditter fra en NGM-plade i dråben af dissekeringsopløsning. Det er bedst at vælge ca. 10 pr. dias, men ikke så mange, at de ikke kan dissekeres inden for fem minutter. For at dissekere dyrene skal du krydse nålepunkterne for at lave en X-form og bruge bunden af X til at fastgøre en voksen ned til overfladen af dækslippet.
Placer derefter X-formen umiddelbart bag svælget, ca. en femtedel af kropslængden på en ung voksen eller lige under den klare del af hovedet. Derefter halshugges dyret med en saksbevægelse, der frigives fuldt ud fra kropshulen sammen med en eller begge halvdele af tarmen. For at fiksere prøven med formaldehyd pipetteres fire mikroliter af fikseringsopløsningen på dækslippen, meget tæt på dråben med dyr, samtidig med at man undgår at pipettere direkte ind i dissektionsdråben og fortrænger de dissekerede slagtekroppe.
Fastgør dækslet til holdeglidet med en finger. Med den anden hånd skal du forsigtigt svirpe dækslikket et par gange for at blande dråberne. Hold et positivt ladet dias med forsiden nedad, brug det til at samle dækslippet op i midten af diaset ved forsigtigt at røre ved prøvedråben, og overfladespændingen af dråben vil samle dækslippet op.
Sæt rutsjebanen på bænken, og fastgør i nøjagtigt fem minutter ved stuetemperatur. I løbet af denne tid skal du mærke diaset med en blyant. For at fryse sprækker prøven ved hjælp af flydende nitrogen, mens du holder den mærkede kant af diaset med pincet, skal du forsigtigt sænke den til flydende nitrogen.
Slip glideren, således at den læner sig mod siden af bægerglasset med dæksiden opad, og lysbillederne fryses inden for 10 sekunder. Hvis du bruger tøris til at fryse, efter at have skrabet frosten af overfladen af aluminiumsblokken med en barbermaskine, skal du holde den mærkede kant af diaset fast og sætte den på den ryddede overflade og lægge et vist tryk nedad for at sikre fuld kontakt med blokken. Frysning sker inden for 10 sekunder, da prøven under dækslen bliver til is.
Fjern den frosne glide ved at holde godt fast i gliderens mærkede korte kant, og afstiv en lang kant mod bænken. Med den anden hånd skal du holde fast i en barbermaskine og skubbe barbermaskinens kant ned ad rutsjebanen for at svirpe dækslet af og væk fra prøven. Anbring straks diaset i en Coplin-krukke, der indeholder 95% ethanol, og lad diasene stå i ethanol i mindst fem minutter.
Derefter vaskes diasene i PBST tre gange i fem minutter hver ved stuetemperatur, mens du bruger frisk PBST til hver vask. Fluorescensbilleddannelsesresultater af kimlinjekerner viste, at DAPI binder stærkt til DNA. Immunofluorescensfarvning var effektiv, når antistoffet rettet mod RAD-51, en markør for dobbeltstrengsbrud, var til stede som diskrete foci inden for miotiske kerner, co-lokaliseret på kromosomer markeret af DAPI.
Kle-2 heterozygotes mutanter har mindre defekter i kromosomstrukturen, som det fremgår af let uordnet DAPI-farvning og en stigning i dobbeltstrengsbrudstallet, hvilket afspejles i det højere antal RAD-51 foci. Både dissektions- og fryserevnerne kan være vanskelige, så det er vigtigt at arbejde hurtigt og problemfrit. Vi anbefaler at øve disse trin, før du prøver hele protokollen.
For eksempel kan du øve dig i at dissekere i et større volumen væske, som 200 mikroliter, og gradvist arbejde ned til vores anbefalede volumen på fire mikroliter i en dækslip. Denne teknik kan bruges til højopløsningsbilleddannelse på et konfokalt eller struktureret belysningsmikroskop, eller den kan bruges i kombination med DNA eller RNA-FISH, fluorescens in situ hybridisering, for at visualisere, hvordan proteiner lokaliserer sig i forhold til specifikke sekvenser.